Sort by: 

PhD Thesis

Current Selection: 114 PhD Thesis


Paulina Nowak (Sc. Vie 206 - February 8, 2023) Prof. Aurélien Roux; Prof. Robbie Loewith
The role of (m)TORC2 signalling in plasma membrane lipid homeostasisopen archive unige:167452

The (m)TOR pathway regulates cellular metabolism through sensing extra- and intracellular signals. TOR kinase in yeast (mTOR in mammals) assembles in two complexes. While the function of (m)TOR Complex 1 is well established, less is known about (m)TOR Complex 2, mainly due to the lack of specific inhibitors. The study presents a small amphipathic molecule, palmitoylcarnitine, and its derivatives that inhibit (m)TORC2 by intercalating into the plasma membrane (PM) and decreasing its lipid order. The use of cholesterol, an order-modifying lipid, confirmed that (m)TORC2 is sensitive to the PM lipid order. Even under the continued presence of palmitoylcarnitine, (m)TORC2 recovers from inhibition. We showed that the recovery requires a regulation loop between TORC2 and two sterol transporters, Lam2 and Lam4, suggesting the role of sterols in TORC2 recovery. We present details of the connection between PM and (m)TORC2 regulation. These findings may shine a new light on pathologies involving the pathway.

Mireia Andreu Carbo (Sc. Vie 193 - October 4, 2022) Prof. Charlotte Aumeier
Crosstalk between walking kinesin-1 and microtubule network organizationopen archive unige:165634

The microtubule cytoskeleton is a dynamic network that rapidly adapts to changes in the cellular environment. This rapid reorganization results from a tight regulation of the microtubule dynamics. Microtubules undergo phases of growing and shortening through the addition and removal of tubulin dimers at their ends. However, microtubule dynamics is not just controlled at the microtubule ends, but also depends on tubulin exchange all along the shaft of microtubules. Shaft dynamics is a powerful regulator of the microtubule lifespan: shaft damages generated by dissociation of tubulin dimers get repaired by incorporation of fresh tubulin dimers. These repair sites act as rescue sites where a depolymerizing microtubule stops shortening and starts to re-grow. Therefore, the more a microtubule is damaged/repaired, the longer is the lifetime and the length of the microtubule. Given the importance of shaft dynamics, a functional microtubule network relies on the regulation of end- and shaft-dynamics. However, the relevance of shaft dynamics within a cellular context has not been fully explored. Molecular motors use microtubules as roads to transport cargoes within the cell. In this thesis I present that the traffic of kinesin-1 motors also modifies the microtubule tracks while walking on them. First, I demonstrate in vitro that kinesin-1 increases microtubule shaft renewal and, consequently, the microtubule rescue frequency in a concentration-dependent manner. As a result of an increased number of rescue events, microtubules are longer and have an increased lifetime. In cells, an increase in kinesin-1 activity increases the microtubule rescue frequency which ultimately results in a densification of the microtubule network. This local densification of the network changes the shape and polarity of the cell. Second, I reveal that this property of kinesin-1-induced damages along the microtubule shaft is a mean to decrease the levels of acetylation, a tubulin post-translational modification occurring within the microtubule lumen. I demonstrate that the deacetylase HDAC6 relies on microtubule shaft damages as entry sites into the lumen, whereas αTAT 1 acetylation activity is independent from these entry sites. Third, I show that the modulation of microtubule shaft damages by different proteins might be a general mechanism to tune the acetylation array within the cell. Taken together, these results provide a new perspective on the interaction between the molecular motor kinesin-1 and the underlying microtubule network. In addition of transporting cargoes, kinesin-1 modifies the dynamics, lifetime and composition of the microtubules used as tracks. These local changes drive an overall reorganization of the microtubule network which could underlie cell polarization and migration.

Daniel Hummel (Sc. Vie 147 - February 9, 2022) Prof. Marko Kaksonen
SH3 domain-mediated assembly regulation of the endocytic machinery in yeastopen archive unige:160126

Clathrin-mediated endocytosis (CME) is a conserved Eukaryotic trafficking pathway that is driven by a sequentially self-assembled molecular machinery of over 50 different proteins. What protein-protein interactions regulate assembly of the endocytic machinery? I describe how the most abundant PPI domain family in CME – SH3 domains – regulate endocytic protein assembly in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, combining mutagenesis with live cell fluorescence microscopy. My data suggest that most SH3 domains regulate recruitment of their own SH3 protein and SH3 domains that recruit other endocytic proteins do not promote recruitment of their own SH3 protein. Furthermore, multiple SH3 domains mediate the same endocytic component, the Las17/Vrp1 complex (LVC), and interfere with each other. The SH3 interaction network coordinates LVC assembly and dissociation dynamics. My results provide a dynamic map of SH3 functions in yeast endocytosis that can help SH3 research in a broad biological and medical context to conceptualize SH3 interaction networks.

Clément-Alexis Richard (Sc. Vie 168 - July 21, 2022) Prof. Marcos Gonzalez Gaitan
SARA endosome and microtubule asymmetries in Zebrafishopen archive unige:163418

Notch signalling pathway is evolutionarily conserved, in phylogenetically distant species from Drosophila (Insecta) to Zebrafish (Teleostei). Previous studies in the Gonzalez-Gaitan laboratory unravelled the role of SARA endosomes in the regulation of the Notch signal pathway showing that the controlled segregation of these endosomes in asymmetric cell division controls signalling through this pathway. The mechanisms leading to asymmetric SARA endosome segregation were characterized in fly sensory organ precursor by Derivery et al. In Zebrafish spinal cord, Kressmann et al. found that SARA1 endosomes were asymmetrically inherited between daughter cells during neural precursor cell division. However, the mechanism leading to the asymmetric segregation of SARA1 endosomes in Zebrafish remains unknown. In this work, I investigate the Zebrafish homologues of the fly proteins characterized by Derivery et al. to uncover the mechanism responsible for SARA1 endosome segregation in neural precursor cell divisions in a vertebrate. The characterization of this mechanism allows to understand the neurogenesis and development of Zebrafish central nervous system with potential translation in mammals and human biology.

Chloé Roffay (Sc. Vie 178 - July 4, 2022) Prof. Aurélien Roux
Uncoupling the mechanics of membrane tension and cell volumeopen archive unige:164294

Mechanical and biochemical signals play important roles in development and disease. Plasma membrane acts as a mechanochemical transducer to mediate vital processes. We wondered how mammalian cells can regulate their plasma membrane tension in response to osmosis and its interplay with cell volume regulation. We demonstrate the existence of a coupling between plasma membrane tension and cell volume well described by passive physical mechanisms. To understand the role of biochemical signals, we depleted caveolae and inhibited ion transporters and channels, mTORCs, and the cytoskeleton to prove that this coupling is regulated by the excess membrane buffer and is thus partially independent of specific regulatory mechanisms of tension and volume. Additionally, we observed that cell volume and plasma membrane tension coupling is maintained even after multiple cycles of osmotic shocks. Altogether, these findings underlie the robustness of the coupling between plasma membrane tension and cell volume.

Mateusz Kozak (Sc. Vie 94 - January 28, 2021) Prof. Marko Kaksonen
The role of phase separation in the initiation of endocytosisopen archive unige:151630

Clathrin-mediated endocytosis is initiated through an unknown mechanism by a network of weakly interacting proteins. Ede1, the yeast homologue of mammalian Eps15, is an early-arriving endocytic protein and a key initiation factor. In the absence of Ede1, most other early endocytic proteins lose their punctate localisation and the frequency of endocytic initiation is decreased. We show that in yeast cells, an excess of cytoplasmic Ede1 forms large condensates which recruit other endocytic proteins and exhibit properties of phase-separated liquid droplets. We identify a region of Ede1 which is essential both for the formation of the condensates and for the function of Ede1 in endocytosis. Fusion with the Ede1 central region can promote clustering of a heterologous lipid-binding domain into stable plasma membrane domains that repeatedly initiate endocytosis. We propose that the phase separation of Ede1 promotes the clustering of the early endocytic proteins.

Anna-Katharina Pfitzner (Sc. Vie 126 - October 19, 2021) Prof. Aurélien Roux
Membrane remodelling by dynamic ESCRT-III polymersopen archive unige:157797

Multi-subunit ESCRT-III polymers together with the ATPase Vps4 have the unique ability to fission membrane necks from their luminal side, a process that is required for essential cellular functions like cell division and nuclear envelop maintenance. To decipher the mechanism of ESCRT-III membrane remodelling, I applied a vast array of in vitro reconstitution assays and electron microscopy, which revealed the following principles of ESCRT-III activity. First, membrane remodelling is driven by a polymerisation sequence which is determined by its subunits’ biochemical features, second this polymerisation sequence is coupled to changes in polymer architecture and mechanical properties driving membrane deformation and fission, and third the nucleating complex likely determines the orientation of the initial polymer and subsequently generated membrane deformations. Moreover, by introducing the concept of flexible polymers which adapt their shape through dynamic changes of their subunit stoichiometry, my thesis proposes a new mechanism for membrane remodelling by polymerising proteins.

Lyudmil Raykov (Sc. Vie 116 - September 6, 2021) Prof. Thierry Soldati
Identification and characterization of Dictyostelium discoideum conserved response factors involved in pathogen detection and stress signal transductionopen archive unige:155688

La tuberculose reste l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Son agent Mycobacterium tuberculosis (Mtb) est phagocyté par les macrophages alvéolaires qu'il utilise comme hôte pour se propager. Pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'infection, nous utilisons comme système modèle Dictyostelium discoideum (Dd) et Mycobacterium marinum (Mm). Dd est une amibe utilisée comme modèle phagocyte et Mm est génétiquement très proche de Mtb. Nous savons que chez les métazoaires, les TRAFs, GBPs, TRIMs et STATs sont des facteurs interdépendants impliqués dans la réponse de l'hôte contre les bactéries, conservés entre amibes et mammifères, faisant de Dd un excellent modèle pour étudier leur implication primordiale dans la défense cellulaire pendant l'infection. Nous démontrons que Dd TrafE est une E3-ligase qui joue un rôle clé dans la restriction de la croissance intracellulaire de Mm et la préservation de l'intégrité endomembranaire lors d'une infection par Mm ou lors de dommages stériles.

Ilaria Francesca Di Meglio (Sc. Vie 70 - September 4, 2020) Prof. Aurélien Roux
The role of mechanical forces in regulating cell proliferation in encapsulated epithelial tissuesopen archive unige:147687

Tissue morphogenesis entails the processes that generate tissues and organs. These processes are guided by biochemical and mechanical signals that orchestrate cell-scale events to drive tissue-scale changes. While signalling pathways driving morphogenesis are well described, the role/contribution of mechanical forces is less understood. In this work, we use a microfluidic device to encapsulate model epithelial tissues inside hollow hydrogel microcapsules. We show that forces arising from epithelial growth under confinement are sufficient to drive folding. After folding, the tissue continues to grow within capsules until pressure reaches a threshold value that halts cell cycle progression. Interestingly, monolayers confined in softer capsules do not reach this range of pressure and continue to undergo cell cycle progression, indicating that this regulation is substrate-independent. Altogether, these findings underlie the importance of mechanical forces/stresses during shape generation and maintenance in epithelia, and also uncover many further questions regarding tissue shape/size regulation by mechanical feedback.

Nicolas Ecker (Sc. 5440 - March 12, 2020) Prof. Karsten Kruse
Erratic cell motility generated by deterministic actin polymerization wavesopen archive unige:141598

A cell’s ability to move allows it to efficiently follow nutrient gradients and enables complex processes in tissues. Migration is mostly driven by the actin cytoskeleton. Spontaneous actin waves have been suggested to provide a physical mechanism for its organization during migration. We study theoretically the motion of cells driven by spontaneous acts polymerization waves. To this end, we introduce a mean-field description of actin waves. The actin field is confined to an evolving cellular domain by means of a phase-field. First, we show the emergence of spontaneous, traveling waves akin to excitable systems and quantify their dynamics. Next, the phase diagram of possible movement states is determined. In particular, we find erratic motion due to the deterministic emergence of spiral waves and compare these findings to the searching behaviour of immature dendritic cells. Lastly, we simulate cells in confinements and identify conditions of wave synchronization in neighboring cells.

Vladimir Girik (Sc. Vie 30 - September 24, 2019) Prof. Howard Riezman
Investigating sphingolipid metabolism in budding yeast using stable isotope-labeled and caged vacuole-specific probesopen archive unige:125912

Sphingolipids constitute a class of lipid compounds which carry out important structural and signaling functions in the cells. However, the regulation of their biosynthesis is not completely understood. By combining genetics, lipidomics and metabolomics our study shows that localization of serine palmitoyltransferase in the nuclear ER increase ceramide biosynthesis rate. Our knowledge of the metabolism and transport of sphingolipids between intracellular organelles is limited. In this study we characterize caged vacuole-targeted sphingolipid probes which can be released by UV-irradiation. We established a method to investigate the transport of sphingolipids from the vacuole to the ER in vivo. We observed that the depletion of contact sites between the endoplasmic reticulum and the vacuole decreases metabolic conversion and transport of sphingolipids released from the vacuole. Overexpression of contact site protein Mdm1, which expands the contacts between the endoplasmic reticulum and the vacuoles, increases sphingolipid transport.

Benjamin Weiss (Sc. 5328 - April 3, 2019) Dr Jean-Marc Matter, Prof. Joseph Curran
Crossroads at translation initiation: the long and the short of a short and a long 5’ transcript leader and the eukaryotic initiation factor eIF4E3open archive unige:117777

Translation is the biochemical process by which messenger RNAs are used as template for the synthesis of proteins by the ribosome. The first step of translation, initiation, requires the ribosome to find a start codon on the mRNA. Its efficiency depends on the Kozak context and length of the 5’ transcript leader (5’ TL). In eukaryotes, it also requires a series of translation factors (eIF). One of them is the cap binding protein, eIF4E, and is actually part of a family of three in mammals whose the third member, eIF4E3, has never been extensively studied. In this work, we have been focusing on eIF4E3 and tested if the protein was expressed from its short 5’ TL. From this we asked what happens to the eIF4E-cap interaction in the translation of short 5’ TL. Finally, we studied the function of eIF4E3 and determined a possible role in stress conditions.

Cristina Bosmani (Sc. 5287 - December 6, 2018) Prof. Thierry Soldati
Role of the D. discoideum flotillin homologues in phagocytosis and Mycobacterial infectionsopen archive unige:112873

La tuberculose est une maladie qui tue chaque année presque 2 millions de personnes dans le monde. Elle est causée par une bactérie appelée Mycobacterium tuberculosis (Mtb), qui est ingérée par phagocytose par les macrophages alvéolaires. Mtb est capable de manipuler le mécanisme de maturation du phagosome afin de résider dans un compartiment qui n’est pas bactéricide et s’y multiplier. Nous avons utilisé les modèles alternatifs Mycobacterium marinum et Dictyostelium discoideum pour étudier les mécanismes moléculaires qui permettent aux mycobactéries d’établir une infection dans leur hôte. Nous avons caractérisé la famille de protéines vacuolins chez D. discoideum, et montré que celles-ci sont impliquées dans l’internalisation de particules. De plus, ces protéines sont induites et recrutées au compartiment contenant M. marinum lors d’une infection, et sont manipulées par le pathogène pour pouvoir sortir du compartiment. Nous suggérons que ces protéines de l’hôte sont nécessaires au pathogène pour établir son infection.

Laurent Brodier (Neur. 222 - January 17, 2018) Dr Jean-Marc Matter
Atoh7 controls mitochondrial activity along the pathway converting pre-committed progenitors into retinal ganglion cells in retina adapted for high acuity visionopen archive unige:103549

How metabolism is rewired during embryonic development of the nervous system is still largely unknown because tracing metabolic activities with spatiotemporal resolution during neurogenesis remains a major technical challenge. Here, we investigated changes in the number of active mitochondria in the developing avian retinas, focusing on the conversion of progenitors into retinal ganglion cells (RGCs). Our study uncovers how ATOH7 and HES5.3 influence the dynamic changes in the number of active mitochondria as cells transit from uncommitted to pre-committed progenitors and then to newborn RGCs. There is a transient decrease of mitochondrial activity few hours before cells become committed to the RGC fate. While there is a general trend toward fewer mitochondria when retinogenesis begins, cells that enter the RGC lineage, as well as newborn RGCs, recover the high number of active mitochondria that characterizes uncommitted retinal progenitors. We assessed metabolic dynamics at the onset of cell differentiation by monitoring changes in metabolite concentration in vivo. Combined, our approaches identify changes in metabolic activities which are intrinsically linked to cell fate determination.

Augustinus Galih (Sc. 5207 - May 3, 2018) Prof. Howard Riezman
Cytotoxicity of neuropathy-causing lipids 1-deoxy-sphingolipidsopen archive unige:104519

Hereditary sensory and autonomic neuropathy type IA and IC (HSAN IA/IC) are caused by autosomal dominant mutations that lead to the accumulation of atypical lipids called 1-deoxy-sphingolipids. How the lipids perturb the physiology of the cell are largely unknown. By combining genetics, lipidomics, and chemical proteomics approaches in the budding yeast, our study showed that there are two sequential and overlapping events in the cell. The first event comprises perturbations of actin organization, alteration of the shape of mitochondria, and formation of hydrophobic bodies by 1-deoxy-sphinganine. These aberrations, however, are not sufficient to kill the cell. The second event is the toxicity of C26 1-deoxy-ceramide. The lipid might directly inhibit a multisubunit essential protein that has broad impacts, directly inhibit multiple essential proteins, or perturb the structure of cellular membranes. Each of these perturbations is sufficient to kill the cell.

Marco Garieri (Sc. 5197 - March 19, 2018) Prof. Ioannis Xenarios, Prof. Emmanouil Dermitzakis
Dissecting the variability of molecular phenotypes in population cell lines and single cellsopen archive unige:103459

In this thesis, the regulation of gene expression is analyzed in three different aspects. At first by understanding how the genetic variation has a downstream effect on gene expression through the variation of activity of regulatory elements, such as promoters and enhancers. In particular, we identified cases of promoters compensation with no evidence of differences in the total gene expression. In the second part of the thesis we investigated the cellular variability of gene expression in two different contexts: firstly, we studied the X chromosome inactivation (XCI) happening in female individuals. We observe extensive heterogeneity of this mechanism within and between individuals and tissues. And secondly, we integrated single-cell gene expression quantification and DNA variation to identify cell-type specific expression quantitative trait loci (eQTLs) in the human pancreatic islets.

Jorge Larios (Sc. 5220 - May 25, 2018) Prof. Aurélien Roux, Prof. Jean Gruenberg
Regulation of ESCRT endosomal recruitment by the lipid-binding protein ALIXopen archive unige:106922

The endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) is a multiprotein complex that participates in processes which require membrane deformation, such as cytokinetic abscission, and multivesicular body (MVB) biogenesis. MVBs contain intraluminal vesicles (ILV), the formation of which plays a key role in the delivery of ubiquitinated cargo to lysosomes for degradation. ALIX is an ESCRT-associated protein known to interact with TSG101 and CHMP4, two ESCRTs, and a late endosomal lipid, LBPA. ALIX and LBPA participate in ILV formation, yet the mechanism by which they act is unknown. Here, we show that ALIX recruits ESCRT proteins, mainly CHMP4, to late endosomes, in an LBPA-dependent manner. Additionally, ALIX overexpression induces the endosomal accumulation of ubiquitinated proteins, providing evidence that the sorting of several specific transmembrane proteins depends on ALIX. Altogether, we illustrate the importance of ALIX and LBPA in the recruitment of ESCRTs and in the sorting of specific cargo.

Hetty Manenschijn (Sc. 5287 - September 10, 2018) Prof. Marko Kaksonen
The role of myosin motors in endocytosis in yeastopen archive unige:114611

Clathrin-mediated endocytosis is a conserved process by which eukaryotic cells take up molecules from their environment. Endocytic membrane bending in budding yeast requires the construction of a dynamic actin network, which produces force to deform the plasma membrane against the turgor pressure. The type-I myosins Myo3 and Myo5 are essential for endocytosis, but how they contribute to remains unknown. The goal of my PhD thesis was to investigate these proteins to clarify their role in endocytosis in yeast. Using quantitative live cell imaging and genetic perturbations, I show that Myo3 and Myo5 stimulate actin network growth in a dose-dependent way, which controls the speed of coat movement. This ability does not depend on their Arp2/3-activating domain. Together, these findings refine our understanding of the role that Myo3 and Myo5 play within the endocytic machinery and suggest a novel role for type-I myosins in facilitating actin network growth under high loads.

Deepikaa Menon (Sc. Vie 3 - September 25, 2018) Prof. Marko Kaksonen
Regulation of membrane scission in yeast endocytosisopen archive unige:155106

Endocytosis is an ancient pathway that regulates communication of the cell with its environment. During this process, the plasma membrane is reshaped in a controlled sequence: a flat membrane forms an invagination that undergoes scission to produce a cargo-filled vesicle. Breaking the membrane invagination to form a vesicle is perhaps the most dramatic shape transition in this development, exciting a large body of literature addressing the cause of membrane scission. Work on mammalian cells has converged on a scission mechanism based on membrane neck constriction by the GTPase dynamin. A clear understanding of what causes scission remains incomplete for the much simpler endocytic network in yeast cells. In this thesis, I investigate the mechanism of membrane scission in Saccharomyces cerevisiae and the proteins involved by combining mutagenesis with live-cell imaging of fluorescently-tagged proteins. Endocytic sites are very stereotypic in yeast, recruiting about 50 proteins- most with mammalian homologues- in a highly specific sequence. These proteins can be assigned to separable modules based on their role in endocytosis. Members of the coat module arrive when the membrane is still flat and form the template for invagination. Actin regulators arrive later and produce the forces required to pull up the membrane. Scission proteins arrive at the end of the timeline and regulate vesicle formation. The yeast BAR domain complex Rvs is an important regulator of scission: in cells without Rvs, scission efficiency decreases by nearly 30%. The 70% of invaginations that undergo scission in the cells form smaller vesicles than in wild-type cells. Rvs thus appears to regulate both timing and likelihood of scission, but it has not been clear how it does so, or how it gets recruited to membrane tubes in the first place. I find that Rvs localization is timed by its BAR domain. The BAR domain senses a particular membrane shape, and Rvs is only recruited to endocytic sites once this shape is acquired. Surprisingly, localization efficiency and localization itself is affected by a second domain of Rvs167, the SH3 domain. This domain helps recruitment of Rvs and could couple the actin network to vesicle scission, triggering disassembly of the actin network once scission occurs. Several models have been proposed for what eventually causes scission. I test predictions of some of these models. I find that forces generated by dynamin and lipid hydrolysis do not drive vesicle formation. Scission timing is also independent of the number of BAR domains recruited to membrane tubes, so is not based on BAR concentration-dependent membrane rupture. Scission timing is instead determined by the amount of actin at endocytic sites, and hence by the magnitude of forces generated on the membrane. There appears to be a threshold force over which the membrane reliably ruptures. The function of Rvs is to scaffold the membrane, and prevent scission before this force is generated, allowing reliable formation of vesicles.

Ilena Vincenti (Sc. 5294 - December 18, 2018) Prof. Thierry Soldati, Prof. Doron Merkler
Brain-resident memory CD8+ T cells: roles in protection and diseaseopen archive unige:113169

Memory T cells (TM) are important components of the immunological memory. Resident memory T cells (TRM) are a subset of TM that reside long-term at sites of previous infection. This thesis investigated the functioning of virus-induced TRM in the brain. Brain TRM (bTRM) proved to be potent and autonomous defenders of the brain against a viral re-infection by rapidly acquiring proliferative and cytotoxic programs as well as by producing cytokines. Thereby, bTRM protected this important and vulnerable organ against otherwise fatal immunopathological disease. In contrast to this beneficial role of bTRM, virus-induced bTRM that recognized a neo-self-antigen presented by CNS-resident cells triggered a local inflammation and an autoimmune-like disease. Accordingly, inflamed brain areas of patients suffering from the human autoimmune disease Multiple Sclerosis contained high numbers of bTRM. This work therefore highlighted a potential double-edged role of bTRM. While virus-specific bTRM are potent immune defenders of the CNS against re-infection, self-reactive bTRM likely contribute to brain autoimmune diseases.

Julien Cachat (Sc. 5104 - May 11, 2017) Prof. Thierry Soldati, Prof. Karl-Heinz Krause
Role of NOX2 as regulator of the adaptive immune responseopen archive unige:96485

NOX2 is an enzymatic complex that produce oxygen radicals and is important for killing pathogens. A lack of function mutation in genes coding for NOX2 or its subunits cause a hereditary disease called chronic granulomatous disease (CGD). In addition to recurrent infection, CGD patients are also more prone to develop autoimmunity. This suggests an important role of NOX2 in controlling the adaptive immune response. The aim of this thesis was to study this role. We therefore used ovalbumin (OVA) as antigen and curdlan or alum as adjuvant to study the humoral and T cell response in NOX2-deficient and WT mice. We found that NOX2-deficient mice produced more OVA-specific IgG2c antibodies. This increased antibody production was associated with an enhanced Th1 response. We also demonstrated that NOX2-deficient dendritic cells are more efficient in activating T cells than WT DCs. Finally, NOX2-deficient DCs produce more Th1-driving cytokine that WT DCs.

Nicolas Virgile Calo (Sc. 5105 - June 29, 2017) Prof. Howard Riezman, Prof. Michelangelo Foti
Roles of mir‑21 in the development of non‑alcoholic fatty liver disease and hepatocellular carcinomaopen archive unige:96489

Non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a liver metabolic disorder that can progress to non alcoholic steatohepatitis, cirrhosis, and ultimately hepatocellular carcinoma (HCC). The miRNA miR 21 is upregulated in steatotic livers and is considered to exert powerful oncogenic functions. The mechanisms by which miR 21 promotes in vivo hepatic metabolic disorders and hepatocarcinogenesis are however still unclear. We therefore aimed at better delineating the in vivo roles of miR 21 in NAFLD and HCC pathogenesis. We demonstrated that mir-21 alters the expression of critical metabolic regulators of the liver to promote metabolic disorders induced by excessive energy intake in mouse, such as glucose intolerance, increased adiposity, hepatic insulin resistance and steatosis. We however also showed unexpected mir-21 tumor suppressive functions against chemically- and genetically-induced HCC, likely through a hepatic anti-inflammatory action. mir 21 silencing could thus constitute a therapeutic strategy for the treatment of metabolic pathologies, but might be detrimental when used against HCC.

Alicia Daeden (Sc. 5146 - November 15, 2017) Prof. Marcos González Gaitán
Asymmetric mechanics of cell-size control during asymmetric cell divisions in sensory organs precursorsopen archive unige:111143

In Drosophila Sensory Organ Precursors (SOP), asymmetric cell division gives rise to two daughter cells with different cell size, the PIIB being smaller than its sibling the PIIA daughter cell. Most of the studies of cytokinetic mechanics focus on the equatorial constriction ring and the positioning of the spindle, however an actomyosin cortex is also present at the poles of dividing cells. In this study, we show that in wild-type SOP, an asymmetry of cortical actin is built during division, with more cortical actin in the bigger PIIA daughter. By using nanobody targeting experiments as well as FRAP, laser ablation and mutant conditions, we investigate how this polar actin cortex regulates cell shape to generate a proper asymmetric cytokinesis in SOPs. We demonstrate that this polar cortex has a big contribution to the final cytokinesis shape and that perturbing this asymmetry of cortical actin leads to daughter cell size inversion.

Shem Johnson (Sc. 5059 - January 31, 2017) Prof. Jean Gruenberg
Searching for novel players in intraluminal vesicle formation and dynamicsopen archive unige:93095

The defining morphological characteristic of endosomes is their multivesicular appearance, a product of the formation of intraluminal vesicles (ILVs) that bud from the limiting membrane and into the interior. It is poorly demonstrated how these ILVs arise, and what factors govern their formation and dynamics. In this study, we aimed to develop a robust methodology to monitor ILV formation and back-fusion by analyzing cargo known to traffic via ILVs in the endocytic system and to find novel candidates involved in this process. We have devised and tested a number of novel methods for monitoring the formation and dynamics of ILVs in the endocytic system and characterized the trafficking of ILV-dependent cargo.

Ana Teresa Lopez Jimenez (Sc. 5153 - December 14, 2017) Prof. Thierry Soldati
Fate of intracellular mycobacteria and host response to vacuolar escapeopen archive unige:101548

La tuberculose est une menace majeure pour la santé humaine. Son agent responsable, Mycobacterium tuberculosis, est une bactérie qui infecte les macrophages alvéolaires et détourne les voies bactéricides qui normalement protègent les poumons de l’infection. Certaines des grandes étapes du cycle d’infection intracellulaire de cette bactérie ont été décrites pour la premiére fois il y a moins de 10 ans. Par conséquent, des aspects importants de la pathogénicité des mycobactéries et des défenses de l’hôte pendant l’infection restent à explorer. Ici, nous avons utilisé le systéme bien établi composé par le modèle de macrophages, l'amibe sociale Dictyostelium discoideum, et la bactérie de la tuberculose du poisson Mycobacterium marinum, pour disséquer plusieurs aspects de cette interaction. Ce système est non seulement plus manipulable expérimentalement, mais permet également l’étude des mécanismes de base de la pathogénicité des bactéries et des défenses cellulaires autonomes, qui sont hautement conservées. Dans cette étude, nous avons étudié le cycle intracellulaire de M. marinum dans son hôte D. discoideum, au stade unicellulaire. Pour cela, nous avons utilisé la microscopie en temps réel à long terme de cellules infectées vivantes piégées dans un dispositif microfluidique appelé InfectChip. Cette approche a permis de suivre des cellules individuelles infectées et a révélé l’hétérogénéité des destins de la bactérie et de l'hôte au cours de l0infection, qui ne pouvaient pas être observés auparavant au niveau de la population globale. De plus, nous avons analysé l’effet de plusieurs facteurs de l0hôte, de la bactérie et environnementaux sur ce processus. En particulier, nous avons étudié l'important locus génétique mycobactérien, appelé ”Region of Difference 1” (RD1), impliqué dans la virulence; l0impact de l'évasion non-lytique de la bactérie par exocytose et par éjection médiées par les protéines de l'hôte WshA et RacH, respectivement, ainsi que le rôle antibactérien de l0autophagie. En outre, nous avons examiné comment le manque de nutriments pour l'hôte affecte le cycle intracellulaire mycobactérien et conduit à la guérison de l'infection au cours du stade multicellulaire facultatif de D. discoideum. M. tuberculosis et M. marinum induisent la formation de lésions membranaires dans le compartiment intracellulaire où ils résident, ce qui permet leur translocation vers le cytosol de l'hôte à des stades tardifs de l'infection. Il a été montré que les membranes endommagées ainsi que les bactéries en translocation sont détectées par l'hôte, qui utilise plusieurs voies pour défendre le cytosol. Ici, nous avons montré pour la première fois que le Complexe de Triage Endosomal Requis pour le Transport (ESCRT) participe à la réparation des dommages membranaires induits par M. marinum chez D. discoideum. Les protéines ESCRT Vps32 et Vps4 marquées avec la GFP sont recrutées aux sites de dommages de la membrane du compartiment contenant les mycobactéries (MCV). De plus, un mutant de l'hôte dépourvu de la protéine ESCRT Tsg101 permet à la bactérie de s'échapper plus tôt du MCV, ce qui a des conséquences importantes sur le devenir de la bactérie. Enfin, nous avons également abordé le rôle de la famille des Discoidines, des lectines cytosoliques de D. discoideum, au cours de l0infection mycobactérienne. Nous avons observé que ces protéines se lient à l'enveloppe cellulaire de M. marinum lorsque les bactéries sont exposées au cytosol. Cette interaction suggère un nouveau mécanisme potentiel de reconnaissance des mycobactéries par l’hôte, qui pourrait être impliqué dans la défense contre l’infection.

Guillaume Molinard (Sc. 5099 - January 24, 2017) Prof. Aurélien Roux
Probing and modelling membrane tension in the context of ESCRT-III regulationopen archive unige:104617

A living cell is defined by its separation from the exterior medium. Lipids and proteins form this semi-permeable barrier. This boundary is important for the cell to protect itself against biotic or abiotic stresses, and to regulate exchanges with its environment. However, this membrane, eventhough fairly resistant mechanically, is prone to breaking under osmotic stress, which can lead to a damaging stretch of the membrane. In resting conditions, a cell actively maintains an osmotic pressure differential, through active regulation of the cytoskeleton, membrane trafficking and ionic channels. Those long term (minute-hours) processes have been studied in detail in the previous decades but cannot however account for the short term (second-minute) response to acute osmotic shocks, and thus the processes by which cells cope up with osmotic shock remains elusive. How do cells react immediately to osmotic stresses before their machinery tries to counteract it ?

Julie Perroud (Sc. 5043 - January 27, 2017) Prof. Jean Gruenberg, Prof. Laurent Bernheim
Involvement of Nuclear Factor of Activated T-Cells (NFAT) transcription factors during human primary myoblast differentiationopen archive unige:94561

Calcium signaling plays key roles during human myoblast differentiation. The calcium-dependent phosphatase Calcineurin is essential for myoblast differentiation and muscle regeneration. NFAT transcription factors (Nuclear Factor of Activated T-cell) are the major Calcineurin targets. By investigating their expression and their role, I found that three NFAT are present in human primary myoblasts, NFATc1, NFATc3 and NFATc4. Surprisingly, while their expression increased during differentiation, NFATc1 is more expressed in myotubes and NFATc4 in the reserve cells. Although NFATc3 is expressed in both cell types but does not seem to have a particular role during myoblast differentiation. When NFATc1 or NFATc4 expression is impaired by siRNAs, differentiation is affected. The expression of late differentiation markers, Myosin HC and STIM1L, is decreased and myotube formation is impaired, but differently. Indeed, NFATc1 knockdown strongly reduced the number and the surface of myotubes formed, NFATc4 knockdown increased myotube surface and reduced the reserve cells pool.

Margot Riggi (Sc. 5158 - December 18, 2017) Prof. Aurélien Roux, Prof. Robbie Joséph Loewith
The Role of TOR Complex 2 in the Maintenance of Plasma Membrane Tension Homeostasisopen archive unige:102521

Constant changes in the environment constitute a threat for the maintenance of the homeostasis of an organism, and require all uni- or multicellular species to adapt in order to survive and prosper. The two multiprotein TOR Complexes, both nucleated around the conserved Target Of Rapamycin kinase, are now broadly considered as major regulators of eukaryotic cellular growth, serving as direct transducers of extracellular biotic and abiotic signals. On top of this traditional view, there is growing evidence that they also act as mediators of various aspects of cellular and organismal homeostasis. Specifically, TORC2 plays a key role in the maintenance of plasma membrane tensile homeostasis. Indeed, despite its established importance in the orchestration of many biological processes both at the cellular and tissue levels, little is known about the necessary mechanisms that regulate plasma membrane tension under ever-changing conditions due to extrinsic stressors or intrinsic phenomena such as growth. The general goal of this project was thus to investigate TORC2-mediated control of plasma membrane tension. L’homéostasie d’un organisme quel qu’il soit est en permanence menacée par les perturbations incessantes de son environnement, et qui exigent de toutes les espèces uni- ou multicellulaires qu’elles soient capables de s’adapter pour survivre et se développer. Les Eucaryotes ont optimisé des mécanismes de régulation finement ajustés et très conservés au cours de l’évolution, permettant leur croissance en cas de conditions propices, tout en garantissant leur survie lors de périodes défavorables.Les deux complexes multi-protéiques TORC1 et TORC2, tous deux organisés autour de la kinase TOR, sont aujourd’hui généralement considérés comme les principaux régulateurs de la croissance cellulaire chez les Eucaryotes, détectant de multiples informations biotiques et abiotiques en provenance de l’environnement, puis les transmettant à la machinerie cellulaire. En plus de cette vision traditionnelle, les complexes TOR sont désormais également envisagés comme étant les médiateurs de nombreux aspects de l’homéostasie cellulaire et de l’organisme. En particulier, TORC2complexe joue un rôle central dans le maintien de la tension de la membrane plasmique.En effet, bien que la tension membranaire soit clairement reconnue comme étant un facteur clé dans l’orchestration de nombreux processus biologiques, tant à l’échelle cellulaire que tissulaire, les mécanismes assurant sa régulation face à de constantes perturbations aussi bien environnementales que résultant de phénomènes intrinsèques (comme la croissance cellulaire par exemple), restent encore très mal connus. L’objectif général de ce projet était donc d’étudier comment TORC2 participe à la régulation de la tension de la membrane plasmique.

Valentina Galli (Sc. 4905 - February 18, 2016) Prof. Aurélien Roux
Visualizing the GTPase activity of dynamin with nanobodiesopen archive unige:82295

Dynamin is a large GTPase that mediates membrane fission at the last step of clathrin mediated endocytosis through helical polymerization and membrane constriction of the neck of the clathrin coated vesicle triggered by GTP hydrolysis. One current model states that membrane fission occurs with a concerted constriction of the dynamin polymer along the neck of the membrane which reduces its inner diameter by sliding of adjacent turns. In vitro studies have shown that fission events are stochastic and that dynamin has no cooperativity towards GTP hydrolysis, thus it is still unclear how dynamin can coordinate such constriction events in vivo and the dynamics of dynamin constriction events in cells have never been revealed. Here, we select a conformational-specific nanobody (dynact), able to bind preferentially to the GTP hydrolyzing/constricted state of dynamin 1 and we describe the occurrence of GTPase activity of dynamin 1 in mice fibroblasts. By analyzing the colocalization over time of dynamin 1 and dynact, we show that GTP hydrolysis/constriction events in cells are unpredictable and can occur at different times during dynamin permanence at the membrane and are not correlated with the size of the dynamin polymer, confirming the stochasticity of dynamin activity during the fission event.

Annika Hohendahl (Sc. 5031 - December 16, 2016) Prof. Aurélien Roux
Regulation of dynamin-mediated membrane fission by the N-BAR protein endophilinopen archive unige:91833

Eukaryotic cells are composed of different compartments with defined biological functions. Transport of molecules from one compartment to another, as well as from and to the plasma membrane, occurs via membrane vesicles. Clathrin-mediated endocytosis is the most studied pathway for the formation of such a vesicle. The GTPase dynamin mediates the final membrane fission step in this process. This thesis describes the experimental work to clarify how a specific class of crescent-shaped proteins called N-BAR proteins regulate dynamin-mediated membrane fission. Endophilin, one of the N-BAR proteins, was taken as an example. The major experimental technique is the nanotube pulling assay, an in-vitro essay using purified proteins. Other chapters of this thesis explore curvature-inducing properties of the clathrin adapter AP180 and the curvature-dependent activity of yeast Vps34 complex I. Additionally, this thesis analyses structural consequences of mutations in dynamin and another N-BAR protein, BIN1/amphiphysin 2, which cause the hereditary muscle disease CNM (centronuclear myopathy).

Sarah Machado (Sc. 4964 - July 25, 2016) Prof. Marcos González Gaitán
Dpp signalling gradient scaling and cell size regulation in Drosophila wing imaginal discsopen archive unige:86713

How growth of a developing tissue is regulated is far from being understood. Tissue growth involves complex biological and mechanical processes that operate from the global systemic level to the local cellular level. The present work investigates two important growth-regulatory processes. The first part focuses on the mechanism by which the morphogen Dpp regulates growth and patterning of the Drosophila wing disc. In particular, it explores how wing disc growth is coordinated with the expansion of the Dpp gradient: a phenomenon that is termed scaling. The second part of this thesis tackles the dynamics, the role, and the mechanism of cell volume changes during mitosis of cultured and columnar epithelial cells. This work establishes assays and a set of analytic methods to study cell size and geometrical properties over time.

Alejandro Melero Carrillo (Sc. 4896 - January 22, 2016) Prof. Howard Riezman, Prof. Aurélien Roux
Visualizing the GTPase activity of dynamin with nanobodiesopen archive unige:85258

Inside the cell, transport of proteins and lipids between organelles is mediated by membrane carriers known as vesicles. The formation of these vesicles requires the participation of coat proteins which are capable to change the shape of membranes into extremely curved structures, ultimately catalyzing the scission and release of a free vesicle to the cytoplasm. Vesicular transport from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi apparatus is mediated by Coated Protein complex II (COPII). COPII vesicles are formed in discrete areas known as ER exit sites (ERES). This coat complex comprises several proteins which bind sequentially to the membrane. Initially, the transmembrane protein Sec12 recruits the small GTPase Sar1, which on its GTP form release an insert an alpha-helix on the ER surface. Then the heterodimer Sec23/24 is recruited to the membrane, which in coordination with Sar1 and cargo proteins form a pre-budding complex. On a latter step, the heterotetramer Sec13/31 scaffolds over the pre-budding complex and completes membrane deformation to form a bud. The last step requires the scission of the vesicle from the ER membrane, a process that is not yet well characterized but that may depend on Sar1. The lipid requirements to deform the ER membrane are largely unknown. In this study it has been found a novel link between lipids and COPII vesicle formation in Saccharomyces cerevisiae. A mutation that affects COPII proteins recruitment, sec12-4, can be rescued by the overexpression of phospholipases, which are enzymes that hydrolyze glycerophospholipids into lysophospholipids and free fatty acids. Lysophospholipids are conical lipids whose accumulation may induce changes in curvature or membrane fluidity. Lipidomics have revealed that lysophospholipids accumulate in rescued sec12-4 mutants overexpressing these phospholipases. Furthermore, COPII vesicles have been generated with in vitro budding techniques and the lipidome analyzed by mass spectrometry. Interestingly, these vesicles had four fold more lysophospholipids than the the proportion of lysophospholipids present in the ER. Finally, in vitro reconstitutions have been used to explore the effect of lysophospholipids on the binding of COPII proteins to artificial liposomes. Confocal microscopy images have revealed that lysophospholipids increase the binding of Sec13/31 to the membrane and affects the organization of the coats over the surface of giant liposomes. The results obtained in this study establish a new link between lysophospholipids and COPII vesicle formation. Their extreme conical shape may cause changes in membrane rigidity or packing defects and by that help COPII coats to deform ER membrane.

Tania Rodrigues (Sc. 4986 - October 11, 2016) Dr Jean-Marc Matter
Analysis of mechanisms that control the onset of neurogenesis in the avian retinasopen archive unige:89585

The macula and fovea located at the optical centre of the retina make primate visual perception unique among mammals. Our current understanding of retina ontogenesis is primarily based on animal models having no macula and no fovea. However, the pigeon retina and the human macula share a number of structural and functional properties that justify introducing this new model system for retina development. Comparative transcriptome analysis of the pigeon and chicken retinas during development reveals that the pigeon’s genetic programs underlying cell differentiation are postponed until the end of the period of cell proliferation. The late onset of neurogenesis has a profound effect on the developmental patterning of the pigeon’s retina which challenges the current models of retina development. The pigeon’s retinal epithelium is inhibitory to cell differentiation and results in the uncoupling of tissue growth and neurogenesis. These developmental features allow the pigeon to build a retina that displays the structural and functional traits typical of primate macula and fovea.

Patricia Vazquez Pico (Sc. 5036 - December 1, 2016) Prof. Marcos González Gaitán, Prof. Bernhard Wehrle-Haller
The role of paxillin in the signalling of the alphavbeta3/talin/kindlin complexopen archive unige:93856

Integrins are cell-surface receptors required for cell adhesion, migration, proliferation, differentiation and survival. Many studies propose that signalling by integrins requires the recruitment of the cytoplasmic adapter protein paxillin. However, how paxillin is recruited to integrins is not yet understood. My thesis results support our hypothesis that paxillin coordinates the signal transmission upon integrin beta3 activation. The colocalisation assay of endogenous paxillin with transfected 3 WT and mutant constructs showed that paxillin colocalises better with the constructs having a functional beta3 NPLY motif than those with no functional motif. Motif involved in signal transmission downstream of the integrin. The paxillin constructs deletions showed that LIM 1 and LIM 3 are responsible of paxillin localisation at focal adhesion. Mutational studies led us to design a mutation patch, LIM 3.1, showing less focal adhesions specificity than the LIM 3 constructs suggesting an impaired interaction. This has been confirmed with the FRAP assay as LIM 3 shows specificity to the tyrosine of the beta3 NPLY motif whereas LIM 3.1 does not.

Pauline Bonvin (Sc. 4791 - June 1, 2015) Prof. Jean Gruenberg, Dr Amanda Proudfoot, Dr Nicolas Fischer
Therapeutic targeting of promiscuous and abundant chemokinesopen archive unige:74345

Les chimiokines sont une famille de cytokines chemoattractrices impliquée dans la migration des leucocytes. Ces protéines interagissent avec des récepteurs spécifiques mais également avec les glycosaminoglycanes (GAGs) présents à la surface des cellules endothéliales. La surexpression des chimiokines induit un recrutement aberrant des leucocytes, un phénomène identifié dans un grand nombre de maladies inflammatoires et de cancers. Pour cette raison, de nombreux inhibiteurs des chimiokines ont été développés au cours des vingt dernières années, mais sans beaucoup de succès thérapeutiques. Dans le contexte de cette thèse, différentes approches ont été utilisées pour résoudre les problèmes observés lors du développement de médicaments biologiques dirigés contre les chimiokines et pour déterminer les propriétés que devrait avoir un anti-chimiokine idéal. Dans ce but, un inhibiteur naturel des chimiokines, la protéine Evasin-4 ainsi que des anticorps monoclonaux ont été utilisés.

Birgit Kastberger (Sc. 4875 - December 8, 2015) Prof. Jean Gruenberg, Prof. Bernhard Wehrle-Haller
Metabolic control of cell adhesion and migration through beta1A integrin acetylation : be aware of the acetylation switch!open archive unige:80152

Alpha5beta1A integrins form two types of cell-matrix adhesions with differential functions: short, peripherally located focal adhesions (FAs) that provide strong anchorage to the substrate and intracellular signalling; and long, centrally located fibrillar adhesions (FBs) that enable the formation of fibronectin (FN) fibrils in the pericellular space. Despite the critical role of alpha5beta1A integrins for FN deposition during fibrosis, the integrins’ relevant signalling is not well understood. Interestingly, beta1A integrin bears a lysine acetylation site located within integrin’s kindlin recognition sequence in the cytoplasmic tail. Genetic deletion of kindlin has been demonstrated to handicap cell spreading and the formation of thin, centrally located FBs. These facts suggest a functional link between integrin acetylation, kindlin binding affinities, FB formation and FN fibrillogenesis capacities. Therefore, we hypothesized that acetylation of beta1A integrin might function as regulatory switch which defines for each beta1A integrin its FA or FB character.

Marine Lacroix (Sc. 4819 - September 9, 2015) Prof. Jean Gruenberg, Dr Vanessa Buatois
Modulation of the assembly of the IL-6 signaling complex and its biological consequencesopen archive unige:76642

Biological consequences of IL-6 cis- and trans-signaling are described to be homeostatic and pro-inflammatory, respectively. The IL-6R signaling complex has been postulated to be a hexamer identical for inducing both signaling pathways and driven by three distinct sites of interaction. Our aim was to investigate whether the modulation of IL-6 signaling pathways and complex assembly using monoclonal antibodies might translate in vivo and highlight improved IL-6R-targeted therapies. Our data revealed that 1)IL-6 cis- and trans-signaling complexes assemble differently in mouse; 2)this difference highlighted in mouse is not transposable to human; 3)differentially targeting the sites of interaction within the signaling complex results in distinct neutralizing consequences; 4)some physiological effects thought to be mediated by cis-signaling might also be driven by trans-signaling in established inflammation. Finally, anti-IL-6R antibodies with distinct mechanisms of action should allow targeting the inflammatory component of IL-6 while permitting physiological functions to persist in different disease settings.

Maria Romanova Michailidi (Sc. 4839 - October 14, 2015) Prof. Marcos González Gaitán
Mechanism of Dpp transport and Dpp gradient scaling in the wing imaginal disc of Drosophila Melanogasteropen archive unige:84548

An important question in developmental biology is how a developing tissue grows and gets patterned. A key role in this process was attributed to secreted diffusing molecules, morphogens. Decapentaplegic (Dpp), a member of the TGF-β superfamily of ligands, has been shown to act as a morphogen and to control growth of the Drosophila wing imaginal disc. Dpp is secreted from source cells and spreads in the target tissue forming a graded spatial concentration profile. The growth of the Drosophila wing disc correlates with the growth of the Dpp gradient: both its amplitude and its decay length increase. The fine adjustment of the morphogen gradient to the size of the growing tissue is termed "scaling". The goal of the present thesis is to understand the Dpp gradient scaling at the cellular and molecular level. The shape of the Dpp gradient is determined by the dynamics of Dpp transport rates at the tissue level. In order to understand the mechanism of scaling, it is therefore important to understand what links the growing size of the tissue and Dpp transport.

Valentin Trofimov (Sc. 4775 - February 19, 2015) Prof. Thierry Soldati
Identification and characterization of novel antitubercular compoundsopen archive unige:74370

Novel strategies, including phenotypic screenings directly in a host-pathogen system, are needed to discover new drugs against tuberculosis. We used amoebae such as Dictyostelium discoideum and Acanthamoeba castellanii as a host model for in vivo drug screenings. We developed assays to monitor the impact of chemicals and intracellular factors on bacteria health, growth, and virulence mechanisms and intrinsic host defenses. We used GFP fluorescent reporters for quantification of bacteria numbers. We validated the system using known first and second line antimycobacterial drugs.

Aline Dos Santos (Sc. 4650 - March 3, 2014) Prof. Howard Riezman
New Inisgths on Lipid Homeostasis: Systematic Lipidomics of a Yeast Knockout Collection of Genes of Protein Kinases and Phosphatasesopen archive unige:35283

The regulatory pathways required to maintain eukaryotic lipid homeostasis are still largely unknown, which limits the possibilities of hypothesis driven research. Here, we performed a mass spectrometry-based lipidomic screening of yeast strains knocked out for genes of protein kinases and phosphatases, in search for new regulators of lipid homeostasis. We have uncovered novel regulations of lipid homeostasis, revealing a control of acyl chain length by nutrient sensing pathways, a control of complex sphingolipids by a phosphate sensing pathway and new players in the control of sphingolipid metabolism. We showed that systematic lipidomics is a powerful tool to gain novel insights into lipid homeostasis. Due to close interaction between lipid metabolism and other cellular processes it is clear that many of these new lipidomic data from kinases and phosphatase mutants will facilitate the understanding of signaling networks.

Charlotte Gehin (Sc. 4670 - May 9, 2014) Prof. Howard Riezman
A kinome-wide RNAi screen to identify genes controlling membrane lipid homeostasis in human cellsopen archive unige:38035

The control of lipid homeostasis is a fundamental process that allows cells to maintain the unique lipid composition of their membrane compartments and to deal with the energetic fluxes from metabolism. If most of enzymes involved in lipid metabolism are characterized, the question of the genetic control of lipid homeostasis is still outstanding. In order to find genes that control the homeostasis of membrane lipids, I combined a large-scale RNAi screen targeting the human knome with the techniques of targeted lipidomic analysis by mass spectrometry to monitor lipid changes in HeLa cells. Data analysis of the screen allowed the characterization of candidate genes involved in the control of membrane lipid homeostasis. In parallel, in the context of the NCCR Chemical Biology, I developed a robotically-assisted siRNA transfection assay and screened a library of chemicals potentially able to transfect siRNA in Human cells at least as efficiently than commercially available compounds.

Nina Jaensch (Sc. 4676 - June 3, 2014) Prof. Jean Gruenberg, Prof. Reika Watanabe Castillon
The intracellular transport of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in mammalian Chinese Hamster Ovary cellsopen archive unige:38415

GPI-APs are a class of lipid-anchored proteins expressed on the cell surface of eukaryotes. Their potential interaction with ordered lipid domains enriched in cholesterol and sphingolipids has been proposed to function in their intracellular transport. Here, we examined the importance of two saturated fatty acids within the phosphatidylinositol moiety of GPI-APs. These fatty acids are introduced by the action of lipid remodeling enzymes and required for the GPI-AP association within ordered lipid domains. The fatty acid remodeling is not required for both, efficient Golgi-to-plasma membrane transport and selective endocytosis via CLIC/GEEC pathway, whereas cholesterol depletion significantly affects both pathways independent of their fatty acid structure. Therefore, the mechanism of cholesterol dependence seems not related to the potential interaction with ordered lipid domain mediated by two saturated fatty acids.

Lisa Salleron (Sc. 4690 - July 2, 2014) Prof. Thierry Soldati, Prof. Amos Bairoch
Integrated approach for the characterization of the predicted human deoxyribose phosphate aldolaseopen archive unige:40398

Depuis plus de 15 ans la séquence du génome humain est à disposition des chercheurs. On sait qu’il y a approximativement 20’000 gènes qui codent pour des protéines et qu’environ 25% de ces gènes codent pour des enzymes. De plus, il est aussi intéressant de noter qu’il existe de nombreux gènes dont on ne connait pas la fonction qui sont appelé « gènes orphelins ». Dans le cadre de cette thèse, nous avons choisi d’étudier la deoxyribose-phosphate aldolase qui est une enzyme qui effectue la conversion réversible du deoxyribose-5-phosphate en glycéraldehyde-3-phosphate et en acetaldehyde. Des études ont montré qu’une activité enzymatique deoxyribose-phosphate aldolase existe dans certaines cellules humaines, cependant aucun gène codant pour cette enzyme n’a été formellement été identifié. Le but de cette thèse était d’étudier la deoxyribose-phosphate aldolase humaine, de confirmer la protéine responsable de cette activité dans les cellules humaines ainsi que d’étudier cette protéine dans un contexte cellulaire.

Aurélie Gueho (Sc. 4597 - October 10, 2013) Prof. Thierry Soldati
Proteomic characterisation of the Mycobacterium marinum-containing compartment in Dictyostelium discoideumopen archive unige:37210

Dictyostelium discoideum is a professional phagocyte using phagocytosis to feed on bacteria. It is used as a surrogate macrophage to study phagocytosis mechanisms and as a host model organism to study intracellular bacterial infections. Mycobacterium marinum, as its close cousin M. tuberculosis, infects innate immune cells where it stops the maturation of its residing-phagosome to prevent its killing and to establish a compartment where it can replicate. In the following work, we have used the host-pathogen model system D. discoideum-M. marinum to better understand how M. marinum manipulates the maturation of its containing-phagosome. We have established a procedure to isolate mycobacteria-containing compartments. Then, using isobaric labelling and mass spectrometry, we studied quantitative proteomic modifications applied to the M. marinum-containing compartment during the first hours of infection. We also compared the quantitative proteomic composition of compartments containing the pathogenic strain M. marinum to compartments containing non-pathogenic, avirulent or attenuated mycobacteria strains.

Chrystelle Montagne (Sc. 4575 - July 1, 2013) Prof. Marcos González Gaitán
Endocytosis, Sara and cell fate decisions during asymmetric stem cell division in the adult Drosophila midgutopen archive unige:29043

During mitosis, the directional endosome-mediated transport of cell fate determinants is one way to generate daughter cells with different destinies. In Drosophila, internalized Delta ligands and Notch receptors traffic through Sara (for Smad Anchor for Receptor Activation) endosomes. In asymmetric cell division systems, Sara endosomes segregate unequally upon division, which biases Notch signaling and dictates differential daughter cell fate assignation. Besides, Notch signaling is known to regulate cell lineage during physiological renewal of the adult Drosophila midgut. Thus, I studied whether Sara plays a role in intestinal stem cell (ISC) fate decision. Live imaging assays showed that only Sara endosomes are asymmetrically dispatched during ISC mitosis. This directional partitioning of Sara endosomes into differentiating cell indicates that ISCs divide asymmetrically. Moreover, Sara mutant midguts present an accumulation of ‘ISC-like’ cells and a depletion of differentiated cells, similar to a Notch loss-of-function phenotype. Therefore, Sara controls the adult Drosophila midgut homeostasis.

Xuezhi Zhang (Sc. 4628 - December 9, 2013) Prof. Thierry Soldati
Study of reactive oxygen species and NADPH oxidases in an amoeba model systemopen archive unige:33716

The pathogenicity of intracellular bacteria was not acquired during interaction with their mammalian hosts, but as a consequence of the interaction with ancient phagocytic protozoan. The selection pressure for bacteria to escape protozoan predation equipped them with specific mechanisms to manipulate the hostile environment of phagosomes. The NADPH oxidase 2 is dedicated to rapid generation of intraphagosomal reactive oxygen species. Our phylogenetic study revealed that NOX enzymes evolved from prokaryotic Ferric Reductases in early eukaryotes. The evolution of NOX enzymes from iron reduction to ROS generation indicates that NOX enzymes became specialized to interactive cell-cell relations and host-pathogen co-evolution. We used the social amoeba Dictyostelium discoideum to study the conserved biological functions of NOX enzymes. We generated single and multiple NOX KOs to study their functions during bacteria infection and killing. Our studies provide further insights into the multifunctional roles of NOX enzymes in a primitive innate immunity model system.

Christin Bissig (Sc. 4457 - August 24, 2012) Prof. Jean Gruenberg
Viral infection controlled by a novel calcium-dependent lipid-binding module in Alixopen archive unige:23137

Alix plays a role in nucleocapsid release during viral infection, as does lysobisphosphatidic acid (LBPA). However, the mechanism remains unclear. Here we report the discovery of how LBPA is recognized within an exposed site in Alix Bro1 domain. Its all-helical triangle-shaped fold confers selectivity for LBPA over other negatively charged phospholipids, via a pair of hydrophobic residues in a flexible membrane insertion loop at the protein apex — loop that undergoes a conformational change upon membrane association. LBPA interactions also revealed a strict requirement for a structural calcium to bind tightly to the Bro1 domain near the lipid interaction site. Both LBPA- and calcium–binding are necessary for Alix association with endosomes in vivo and for mediating virus infection, as are the ESCRT-binding and dimerization capacity of Alix. We conclude that LBPA recruits Alix onto late endosomes via the calcium-bound Bro1 domain, triggering a conformational change in Alix to mediate membrane fusion and viral infection.

Sharon Epstein (Sc. 4406 - February 17, 2012) Prof. Howard Riezman
The multiple physiological roles of the lipid ceramide in the yeast Saccharomyces cerevisiaeopen archive unige:18851

Les Céramides sont des composants lipidiques cellulaires essentiels. Ils représentent la colonne vertébrale de tous les sphingolipides. Il a été observé qu’ils jouent un rôle important en tant que molécules «signal» lors de différentes transmissions de signal. Les Céramides sont composés d’une base sphingoïde attachée à un acide gras via une liaison amide. Tous les Eucaryotes supérieurs possèdent ce lipide et lors des vingt dernières années les enzymes qui catalysent sa synthèse ont été identifiées dans une grande variété d’organismes. Le but de ce travail de thèse est d’étudier les fonctions physiologiques des Céramides dans la levure en tant qu’organisme modèle. Comment la longueur de l’acide gras incorporé aux Céramides et par conséquence aux sphingolipides complexes influence des processus physiologiques? Quelles autres voies de transduction du signal sont influencées par les niveaux de Céramide dans d’autres organismes modèles tels que le Nématode? En premier lieu nous avons cherché à comprendre les effets de l’accumulation de sphingolipides à courtes chaines lipidiques résultant de l’expression dans la levure de la céramide-­-synthase de plante. L’introduction de la céramide-­-synthase de plante engendre la production de ces Céramides à courtes chaines lipidiques à des niveaux mille fois supérieurs au niveau normalement trouvé dans la levure. Cependant cela n’est pas toxique pour la levure. Nous avons alors pu démontrer qu’il est possible de supprimer le gène essentiel AUR1 dans cette souche de levure et ainsi obtenu une souche de Levure incapable de synthétiser des sphingolipides complexes. Cette nouvelle souche présente un défaut de cytocinèse et accumule des dropelettes lipidiques. Dans un autre travail, nous avons collaboré à la caractérisation des acides gras utilisés préférentiellement par deux des céramide-­-synthases de mammifères. Nous avons utilisé la levure comme système d’expression de gènes hétérologues et avons pu montrer que la céramide-­-synthase de mammifères CerS3, et non CerS2, incorpore des acides gras à longue chaine dans les Céramides. Nous avons également montré que les Nématodes déficitaires pour une céramide synthase spécifique (HYL-­-2) sont très sensibles à l’anoxie. Après optimisation d’un test enzymatique in vitro, nous avons pu observer que HYL-­-2 utilise préférentiellement des acides gras à chaine longue. Durant l’étude des céramide-­-synthases nous avons pu comprendre un phénotype vieux de plus de 10 ans. Dans la levure, la suppression du gène EMP24 sauve un des phénotypes de la souche déficiente pour l’activité de la serine palmitoyl transférase encodée par LCB1. La mutation du gène LCB1 (lcb1-­-100) conduit à un défaut de synthèse des sphingolipides qui sont essentiels à la bonne association à la membrane et localisation des protéines à ancrage GPI (Glycosyl Phosphatidyl Inositol). Nous savons par ailleurs que la suppression du gène EMP24 induit l’activation de l’UPR (Unfolded Protein Response). Nous avons alors décidé d’établir s’il y a un lien entre le défaut de niveaux de sphingolipides et le stress du Réticulum Endoplasmique (RE). Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons élucidé le mécanisme de sauvetage phénotypique de la souche lcb1-­-100 par l’absence du gène EMP24. La suppression du gène EMP24 élève les niveaux de céramides et restaure partiellement la viabilité de la souche lcb1-­-100 à 35°C. Ce sauvetage phénotypique peut être reproduit par l’addition de DTT et donc par l’activation de l’UPR. La suppression du gène HAC1 empêche le sauvetage phénotypique de lcb1-­-100 par l’addition de DTT. L’induction de la synthèse de céramide suite à un stress du RE peut être reproduite dans les cellules Insulinoma (INS-­-1). Dans les cellules INS-­-1 un stress du RE induit la surproduction de céramide dont l’acide gras contient 16 carbones (C16). De manière concomitante les niveaux d’ARN messagers de CerS6 (la céramide-­-synthase spécifique pour la synthèse des céramides à C16 chaine) sont augmentés. Cette étude révèle un lien nouveau entre les céramides et l’UPR, lien conservé chez la levure et chez les cellules de mammifères.

Sabine Kressmann (Sc. 4408 - March 8, 2012) Prof. Marcos González Gaitán
The role of SARA1 Endosomes during neural precursor fate assignationopen archive unige:22150

Les endosomes SARA sont impliqués dans la ségrégation asymétrique des molécules Notch (Coumailleau, 2009). Pour savoir si ces caractéristiques étaient conservées dans le poisson zèbre, nous avons analysé les endosmes SARA dans le neuroépithélium : 1. Les endosomes SARA1 sont une sous-population des endosomes précoces. 2. l’inactivation de SARA1 engendre un phénotype neurogénique. 3. Il existe trois type de lignages: n•n, n•p, and p•p. 4. Dans le lignage n•p, la cellule fille avec des endosomes SARA1 continue à se diviser. 5. SARA1 et Notch sont essentiels pour le lignage n•p. 6. Les endosomes SARA1 contiennent Delta, qui ségrège de manière asymétrique lors de la division du précurseur neuronal. 7. Notch se fait de manière cellulaire autonome entre les deux cellules filles. Ces résultats semblent indiquer que le mécanisme de ségrégation asymétrique des endosomes SARA et Notch est conservé de la mouche drosophile au poisson zèbre.

Sonja Krohn (Sc. 4510 - December 17, 2012) Prof. Jean Gruenberg
Probing atypical chemokine biologyopen archive unige:26143

CCL18 has been reported to be present at high constitutive levels in the circulation and is further elevated in inflammatory disease. Functional cellular responses mediated by CCL18 have been described, however its signalling chemokine receptor remains elusive. In this manuscript we show that CCL18 recruits certain leukocyte subsets, albeit with weak efficacy. We investigated whether CCL18 is modified under inflammatory conditions to produce a more potent chemoattractant, but only minor truncations were observed, indicating that the mature form of CCL18 seems to be the biological relevant form. Our studies indicate a potential anti-inflammatory role of CCL18 based on the selective displacement of GAG-bound chemokines as well as the inhibition of cellular recruitment mediated by a variety of chemokine receptors. The 44KRGR47 cluster in the 40s loop is implicated in heparin binding and in the interaction with CCR3, 4 and 5. In regard to the lack of potent immunomodulatory properties the complex formation of CCL18 with the tick chemokine binding proteins Evasin-1 and -4 was confirmed. In a smaller study the binding properties of CCL2 in rat brain were investigated. Binding studies revealed strong evidence for D6 receptor expression, primarily in the rat brain cortex. This might indicate a role of D6 in behaviour, for which the cortex was shown to play a pivotal role.

Martin Lehmann (Sc. 4407 - February 24, 2012) Prof. Jean Gruenberg, Prof. Vincent Piguet
Characterization of HIV-1 host interactions by advanced fluorescence microscopyopen archive unige:18841

HIV-1 is responsible for the current AIDS epidemic that caused 30 million dead so far. Albeit an overall stabilization of incidence rates and declining new infections, AIDS represents a major health and economic problem to some developing countries. HIV-1 infection mainly occurs through unprotected sexual intercourse and subsequent mucosal transmission. In mucosal tissue dendritic cells (DC) can capture HIV-1 through cell surface receptors (e.g. the C-type lectin DC-SIGN), degrade virions and present viral antigens to T-cells. Remaining intact virions are transferred to CD4+ T-cells at cell-to-cell contacts, called infectious synapses. Both DC-SIGN signaling and actin-containing cellular protrusions are implicated in HIV-1 cell-to-cell transfer, but their definitive role in highly relevant immature DC T-cell transfer remains unclear. HIV-1 replication in CD4+ T-cells and macrophages leads to general immune activation, T-cell depletion and final failure of the immune system. In contrast, most SIV infections in their natural hosts are nonpathogenic. Primate lentiviruses use their Nef proteins to manipulate the communication of T cells with antigen-presenting cells (APC) through cell-contacts named immunological synapses. The interaction of individual HIV-1 virions with cellular proteins during entry and assembly occurs at scales below the diffraction limit of light that is ~200nm. Novel super-resolution microscopy techniques achieve nanometer resolution of fluorescently labeled molecules in intact cells. The cellular factor tetherin directly interacts with budding HIV-1 virions and inhibits their release. The restriction mechanism at the molecular scale remains largely unclear. Establishment of quantitative multicolor super-resolution microscopy enabled the visualization of HIV-1 virions, assembly sites and the cellular organization and restriction mechanism of tetherin. New quantitative tools were established to determine sizes of tetherin clusters, number of tetherin molecules and to test models for tetherin recruitment to HIV-1 budding sites. Live-cell fluorescence and electron microscopy together with genetic and pharmacological approaches were used to show that HIV-1 activates Cdc42 via DC-SIGN signalling to induces membrane extensions in immature dendritic that play important roles in cells to cell-to-cell transfer. The effect of primate Nef proteins on immunological synapses between infected primary T-cells and APCs was characterized by immunofluorescence and high resolution confocal laser scanning microscopy. The inability to disrupt the immunological synapse between infected human T cells and APCs distinguishes HIV-1 from most other primate lentiviruses and could explain important differences in lentiviral pathogenesis. In this thesis, super-resolution and confocal fluorescence microscopy allowed a detailed characterization of HIV-1 tetherin interaction, infectious and immunological synapses that play important roles in HIV-1 transmission and pathogenesis.

Sandrine Morlot (Sc. 4436 - June 11, 2012) Prof. Aurélien Roux
Dynamin-mediated membrane fissionopen archive unige:25589

Membrane fission is required for vesicular traffic between intracellular compartments. Dynamin is a GTPase implicated in vesicle scission during Clathrin-mediated endocytosis. It polymerizes into a helix at the neck of endocytic buds. Upon GTP hydrolysis, conformational changes reduce the helical radius and pitch showing that fission proceeds through a constriction mechanism. We show that the deformation of Dynamin helices is highly concerted and damped by the friction between membrane and Dynamin. To further understand fission, Dynamin polymerization and fission are studied on lipid tubes extruded from Giant Unilamellar Vesicles. Fission occurs at the edge of the helix, where the membrane is strongly curved. A statistical analysis of fission time reveals that the fission reaction can be modeled by a single step energy barrier. The fission time dependence on membrane tension, membrane rigidity and torque is established theoretically and validated experimentally. This work gives a quantitative picture of the energy landscape of Dynamin-mediated fission: the height of the energy barrier of fission is estimated around 70 kBT.

Elham Raeisi (Sc. 4424 - June 7, 2012) Prof. Aurélien Roux; Prof. Raymond Miralbell
Analysis of new potential markers for the immediate evaluation of electrochemotherapy using small animal imagingopen archive unige:26017

L'électrochimiothérapie est un nouveau mode d'ablation tumorale dans le traitement des tumeurs tant au niveau expérimental et les humain. Il est bien connu que l'électroporation se limite à des molécules faiblement-ou non-perméantes. Pour évaluer la nouvelle indication et suivre les cellules électropermeabilisées par ECT, nous a conduit à utiliser des dérivés du glucose comme nouveau marqueurs dans différentes modalités d'imagerie moléculaire et ainsi valider ce type de traitement. Il a été ainsi démontré: le potentiel du 2-NBDG pour révéler l'électroporation "in vitro"; du non-effet de rolipram en captation du 2-NBDG, dans diverses cellules tumorales exposées à des impulsions électriques; Que l'imagerie optique infrarouge par un autre l'IRDye-800CW fournit une surveillance de l'électroporation des tissus "in vivo"; Que l'imagerie TEP FDG, peine à cartographier la perméabilisation de tumeurs; Que l'autoradiographie "in vivo" utilisant un FDG, est une technique pouvant détecter l'effet de modification du flux sanguin par électroporation.

Anne Roller (Sc. 4470 - September 10, 2012) Prof. Jean Gruenberg, Dr Hong Ji
Regulation of IL-17Aopen archive unige:25768

Recent studies have revealed important roles for the cytokine IL-17A in protective immunity against certain infections as well as roles in promoting tissue damage in hypersensitivity diseases, such as psoriasis. The aim of this PhD thesis was to investigate the regulation of IL-17A. In the first part we show that blocking PI3Kδ and PI3Kγ function impaired disease development and reduced IL-17A levels, especially from γδ T cells, in the mouse IMQ induced psoriasis-like model and impaired cytokine production in human cells from psoriasis patients. In the second part we describe the potential regulatory function of CD14+CD16- monocytes which inhibited in vitro IL-17A production from human memory CD4+ T cells and these effects were mediated by H2O2.

Natascha Sattler (Sc. 4443 - June 21, 2012) Prof. Thierry Soldati
Role of the scavenger receptor class B members LmpA, LmpB and LmpC during phagocytosis and phagosome maturationopen archive unige:22004

Mycobacterium tuberculosis invades immune phagocytes and reprograms their otherwise bactericidal phagosome maturation pathway to establish a replication niche. Recent reports indicate that uptake of mycobacteria depends on the scavenger receptors class B (CD36 and SR-B1). We have established Dictyostelium as an alternative host model for pathogenic Mycobacterium marinum, a close cousin of M. tuberculosis. Dictyostelium discoideum possesses three CD36 homologs, the Lysosomal Membrane glycoProteins A, B and C. We investigated the importance of the proteins during phagocytic uptake, killing and digestion. Our results suggest that the plasma membrane protein LmpB is specifically implicated in the uptake of mycobacteria. LmpA, on the other hand, is found on phagolysosomes. Interestingly, cells with reduced LmpA protein levels showed impairments in actin-dependent processes such as phagocytosis and phagosome maturation. Additionally, these cells were more susceptible towards infection with M. marinum. Altogether, our results indicate that LmpA is a host cell defense factor, which modulates the dynamics of the actin cytoskeleton.

Iris Fischer (Sc. 4338 - July 28, 2011) Prof. Howard Riezman, Dr Sandrine Pouly
Involvement of the sphingosine 1-phosphate receptor 3 in neuro-inflammationopen archive unige:17228

The S1P3 receptor belongs to the family of G protein coupled receptors which were demonstrated to have regulatory functions in all systems of the body including the immune, cardiovascular and central nervous system. In this work, the role of S1P3 was characterized in neuro-inflammation in regard to its potential role in the neurodegenerative disease multiple sclerosis. It is shown that the SphK1/S1P3 axis is important in astrocyte signalling and probably involved in their activation in vitro. The work further shows that S1P3 is expressed on reactive astrocyte in MS lesions, but not in the mouse brain during neuro-inflammation. In an EAE study, an animal model used to investigate aspects of the human disease multiple sclerosis, it is demonstrated that S1P3 plays no major role in EAE. The therapeutic relevance of these findings remains open, as S1P3 seems to be able to mediate both deleterious and beneficial effects on astrocytes in MS.

Navin Andrew Gopaldass (Sc. 4350 - September 20, 2011) Dr Thierry Soldati
Role of actin, myosin IB and dynamin A in the phagocytic pathway of dictyostelium discoideumopen archive unige:17260

Dictyostelium discoideum is an amoeba that lives in the soil and feeds on bacteria. This model organism can be used as a surrogate macrophage to study highly conserved processes such as cell motility, phagocytosis, membrane traffic and host-pathogen interactions. This thesis addresses the role of the class I myosin MyoB, Dynamin A and actin dynamics in membrane traffic during phagosome maturation in Dictyostelium.

Ana Belen Moraleda Merlo (Sc. 4322 - June 6, 2011) Prof. Marcos González Gaitán
Sara-binding proteins and their role during asymmetric cell divisionopen archive unige:16698

During TGF-ß signaling, Sara acts as a scaffold protein recruiting the transcription factor to the ligand receptor. Sara is a member of the TGF-ß super family, which associates to endosomes by binding PtdIns(3)P. Sara endosomes are involved in the symmetric partitioning of TGF-ß/BMP signaling molecules during wing development and in the asymmetric distribution of Delta and Notch during SOP asymmetric cell division. We still do not know what mechanisms are involved in Sara endosomal dynamics and trafficking. During my PhD I focused on finding the molecules, which drive the targeted motility of Sara endosomes during SOP asymmetric cell division. Other key questions were i) how Notch and Delta are targeted into Sara endosomes during SOP division,? and ii) what are the Activin target genes during Sara-mediated TGF-ß Signaling? In order to answer these questions, the main goal of my PhD has been to unravel the Sara machinery.

Mathurin Baquié (Sc. 4260 - October 12, 2010) Prof. Howard Riezman; Prof. Claes Wollheim; Dr Benoît Gauthier
Role of LRH-1/NR5A2 in islet physiology and pathophysiologyopen archive unige:12586

The nuclear receptor Liver Receptor Homolog-1 (LRH-1) plays a key role in several biological processes. The correlative association between LRH-1 function induced by estrogens and the protective role of the hormone on pancreatic insulin-secreting ß-cells led us to investigate the potential implication of LRH-1 in islet ß-cell physiology. We demonstrate that LRH-1 is expressed in ß-cells and that transcript levels are modulated by 17ß-estradiol through the ERa signalling pathway. Adenoviral-mediated overexpression of LRH-1 in human islets did not alter proliferation but conferred protection against cytokines and streptozotocin-induced apoptosis. More importantly, incubation of human islets with an agonist of LRH-1 (BL001) also protected islets against cell death caused by cytokines and streptozotocin. BL001 also increased overall ß-cell performance in islets isolated from Type 2 diabetic donors. Our results indicate that LRH-1 could be an attractive target for stimulating islet survival and performance in diabetic patients.

Karim Brandt (Sc. 4241 - July 21, 2010) Prof. Marcos González Gaitán
IL-1β and sIL-1Ra Production in acute and chronic inflammation: regulation and signaling in human monocytesopen archive unige:12160

Le but général de cette thèse est l’étude et la caractérisation des acteurs intracellulaires régissant la production de cytokines pro- et anti-inflammatoires, en particulier celle de l’IL-1β et de son inhibiteur naturel qu’est la forme sécrétée de l’IL-1Ra (sIL-1Ra), par les monocytes/macrophages humains dans des modèles d'inflammation aiguë et chronique.

Ben Brankatschk (Sc. 4265 - November 26, 2010) Prof. Jean Gruenberg
The interplay between endosomal sorting of the epidermal growth factor receptor and signalingopen archive unige:14275

The epidermal growth factor (EGF)-induced removal of the EGF receptor (EGFR) from the plasma membrane and its endocytic downregulation is a major negative feedback mechanism controlling the intensity and duration of receptor signaling. Different mechanisms of ligand-accelerated endocytosis, rapid ubiquitination of activated EGFR, and sorting of the receptor into multivesicular bodies for lysosomal degradation, are the underlying principles of EGFR downregulation. The physical degradation of the EGFR is thought to protect cells from excessive stimulation. In addition, sequestering the receptor into intralumenal vesicles of endosomes, thereby uncoupling the intracellular tyrosine kinase domain from its downstream effectors, is proposed to contribute to signal attenuation. On the other hand, endosomal EGFR can be active and is able to compensate for signaling initiated at the plasma membrane. How the pool of active endosomal receptor is regulated, and to what extend it contributes to the biological response, has not been investigated conclusively to date. In this study, we aimed to dissect the precise contribution of endocytic sorting events to the EGF response. Consequences of perturbations in EGFR sorting, particularly upon interfering with clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, after knockdown of CBL ubiquitin ligases, and of depletion of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) subunits, were investigated in detail. The activation status of signaling components was determined, and a reporter assay was set up to measure EGF-dependent transcriptional activation in living cells. The induction of endogenous target genes downstream of the EGFR-MAPK (mitogen-activated protein kinase) cascade was quantified by real-time RT-PCR, microarray analysis, and by utilizing the recently developed NanoString technology.

David Hakkoum (Sc. 4227 - June 28, 2010) Prof. Reika Watanabe, Prof. Luc Stoppini
The role of Interleukin-6 in nervous regeneration and functional recovery in organotypic hippocampal slice culturesopen archive unige:13222

Le point commun des pathologies affectant le système nerveux central (SNC) des mammifères adulte est qu’elles aboutissent toutes à des pertes de fonction causées par des dommages qui sont le plus souvent irréversibles. Nous savons à présent que l’incapacité du SNC à recouvrer une activité fonctionnelle est principalement liée au fait que les pathologies conduisent souvent à une section des axones qui ne parviennent pas à régénérer. Par conséquent, l’étude et la compréhension des mécanismes de la régénérescence axonale constitue une thématique centrale de la neurobiologie. Le présent manuscrit s’inscrit dans cette perspective générale. Parmi ces mécanismes, la surproduction de l’interleukine-6 (IL-6) est très fréquemment corrélée aux traumatismes et maladies dégénératives du SNC. C’est la raison pour laquelle elle a fait l’objet de nombreuses études. Les conclusions de ces investigations sont loin d’être homogène (voire contradictoire), tant et si bien que l’on parle "d’épée à double tranchant" pour évoquer cette cytokine. Toutefois, peu d’étude ont tenté de connaître le rôle direct d’IL-6 sur la régénérescence axonale et le recouvrement fonctionnel de tissus lésés ce qui constitue précisément l’objectif précis de la présente thèse. Pour ce faire nous avons utilisé comme modèle les tranches organotypiques d’hippocampe de souris et avons montré qu’IL-6 exerce une action bénéfique sur la repousse axonale et le recouvrement d’activité fonctionnelle.

Véronique Raeis Dauve (Sc. 4248 - July 9, 2010) Prof. Jean Gruenberg; Prof. Alex Baertschi
De HIF-1 alpha/FOXO aux canaux KATP : une nouvelle voie de signalisation potentiellement cardioprotectrice chez l'enfant souffrant d'hypoxémie veineuseopen archive unige:12662

Les maladies cardio-vasculaires représentent l’une des premières causes de mortalité dans le monde. Elles suscitent une grande préoccupation mondiale et sont d’autant plus redoutables dans les pays en voie de développement qu’elles sont souvent tardivement dépistées. La chirurgie cardiaque représente aujourd’hui le meilleur moyen de contrecarrer nombre de malformations ou de maladies ; mais les populations qui y ont accès sont encore trop restreintes. Ainsi, il convient de poursuivre la compréhension des mécanismes physiologiques et cellulaires induits lors de problèmes cardio-vasculaires afin d’aider au mieux certains patients via des traitements pharmacologiques.

Ortrud Wartlick (Sc. 4269 - December 13, 2010) Prof. Marcos González Gaitán
Control of proliferation by the Dpp gradient in the wing imaginal disc of Drosophila melanogasteropen archive unige:13137

Morphogens, such as Decapentaplegic (Dpp) in the fly imaginal discs, form graded concentration profiles that control patterning and growth of developing organs. In the imaginal discs, proliferative growth is homogeneous in space, posing the question of how morphogen concentration gradients could control position-independent growth. To understand the mechanism of proliferation control by the Dpp gradient, we quantified Dpp concentration and signaling levels during wing disc growth. Both Dpp concentration and signaling gradients scale with tissue size during development. On average, cells divide when Dpp signaling levels have increased by 50%. Our observations are consistent with a growth control mechanism based on temporal changes of cellular morphogen signaling levels. For a scaling gradient, this mechanism generates position-independent growth rates.

Ana Claudia Da Silva Campos (Sc. 4164 - December 17, 2009) Prof. Marcos González Gaitán
Zebrafish SARA1: Role in signaling during embryo developmentopen archive unige:5276

Durant l’embryogénèse, des nombreuses voies de signalisation sont combinées pour réguler différents processus. Ces voies peuvent être modulées dans la cellule par endocytose. Dans la voie de signalisation TGF-beta, la localisation intracellulaire de ligands, récepteurs et substrats est régulée par l’endocytose. Ainsi, les récepteurs TGF-beta activés phosphorylent les R-Smads, qui transitent dans le noyau, où ils régulent la transcription. La protéine endosomale SARA est une protéine adaptatrice qui se lie au R-Smad et l’amène à proximité du complexe de récepteurs. Notre travail montre que SARA1 est un intermédiaire nécessaire à la signalisation de Nodal pendant le développement embryonnaire. De plus, notre travail montre que SARA1 est nécessaire à la signalisation de Notch pendant les décisions entre devenir épithélium pavimenteux/cubique dans le cœur de l’embryon et les modes de division dans le tube neural. Ces résultats présentent SARA1 comme une protéine qui peut se partager entre deux voies de signalisation distinctes.

Régis Dieckmann (Sc. 4119 - June 29, 2009) Dr Thierry Soldati
Role of the class I Myosin, MyoK, and the actin binding protein 1, Abp1, in phagocytosis in dictyostelium discoideumopen archive unige:3961

Le but de ce travail était de mieux comprendre le rôle des myosines de classe I (M1) dans l’endocytose. L’endocytose englobe l’ingestion et la digestion par la cellule de matériel exogène. Les M1s sont des moteurs moléculaires qui génèrent une tension ou un mouvement. Elles sont formées d’un domaine moteur conservé liant l’actine et d’un domaine de queue de longueur variable qui contient au moins un domaine de liaison aux membranes et, éventuellement, un à deux domaines spécifiques d’interaction protéine-protéine. L’actine, le complexe Arp2/3 de nucléation de l’actine et les M1s sont présentes lors de fermeture d’une vésicule dans tout processus endocytaire. Néanmoins, leur coordination et leur organisation spatiale sont peu connues. Le cycle de polymérisation/dépolymérisation de l’actine ainsi que l’activité contractile des myosines sont également essentiels au processus d’ingestion de particules ou phagocytose. Nous avons étudié le rôle de la M1, MyoK, dans la phagocytose et la dynamique de l’actine dans le modèle de cellule phagocytaire aisément manipulable génétiquement, l’amibe Dictyostelium discoideum.

Miriam Essid (Sc. 4155 - November 20, 2009) Dr Thierry Soldati
The exocyst complex in "Dictyostelium discoideum" : localisation and functional characterisationopen archive unige:5160

L'objectif de cette étude était de disséquer le trafic membranaire chez "Dictyostelium." Nous avons caractérisé la fonction de la petite GTPase Rab8a et de son effecteur potentiel, l'exocyste pendant l'expulsion de liquide par la vacuole contractile (VC). La VC est un système tubulaire et vésiculaire qui contrôle l'équilibre osmotique de "Dictyostelium." La mutation de Rab8a, Drainin ou LvsA affectent la morphologie de la VC et la localisation de l'exocyste. Rab8a-GTP recrute l'exocyste à la membrane de la VC et favorise l'attachement de la VC avec la membrane plasmique afin de permettre la formation d'un pore et l'expulsion de liquide. L'impossiblité de supprimer "sec15", une sous-unité de l'exocyste, indique que l'exocyste est essentiel pour la viabilité cellulaire. Effectivement, la recherche des partenaires d'interaction de l'exocyste a révélé d'autres rôles potentiels dans le trafic vésiculaire, la phagocytose, l'exocytose et mobilité cellulaire.

Kai Hui Hu He (Sc. 4157 - November 27, 2009) Prof. Howard Riezman; Prof. Claes Wollheim; Dr Benoît Gauthier
Role of pax4 in β-cell plasticity : generation of two transgenic mouse modelsopen archive unige:5161

Dans cette étude, l'objectif est de créer deux modèles-animal de surexpression du facteur de transcription Pax4 dans les cellules beta pancréatiques: 1) des souris surexprimant la forme normale Pax4 inductible pour mieux comprendre chez l'adulte les mécanismes par lesquels Pax4 régule la prolifération et la survie des cellules beta et 2) des souris surexprimant la forme mutante Pax4R129W pour mieux évaluer l'implication de cette mutation dans l'évolution du diabète. L'ensemble de nos résultats suggère la simultanéité de deux processus indépendants : dans le premier, Pax4 favorise la protection des cellules beta contre un environnement nocif, en induisant le gène anti-apoptotique Bcl-2 et en réprimant MafA afin de différencier partiellement les cellules beta, dans le second processus, l'expression de Pax4 doit être inhibée afin d'obtenir des cellules pleinement différenciées.

Antje Kuhrs (Sc. 4143 - October 6, 2009) Prof. Marcos González Gaitán
Analysis of Drosophila fragile site-associated (Fsa) in Hedgehog signallingopen archive unige:8578

Il a été montré que le gène Fsa régule l’homéostasie des lipides ainsi que la différentiation cellulaire dans des cellules humaines et chez Caenorhabditis elegans. Dans ce travail de thèse, le gène orthologue de Fsa chez Drosophila melanogaster a été identifié lors d’un crible génétique cherchant à identifier des interactants de Sara, un gène impliqué dans le trafic membranaire et la signalisation cellulaire. La caractérisation de Fsa de drosophile confirme le rôle de ce gène dans l’homéostasie des lipides et implique Fsa comme régulateur négatif de la signalisation Hedgehog. Etant donné que la signalisation Hedgehog, de même que Fsa, est impliquée dans l’homéostasie des lipides et la différenciation cellulaire, les effets observés de Fsa sont peut-être dus à son rôle de régulateur de la voie de signalisation Hedgehog. De plus, il a été montré que Sara interagit fonctionnellement avec Fsa chez la drosophile en tant que régulateur négatif de la signalisation Hedgehog.

Céline Lamacchia (Sc. 4117 - June 26, 2009) Prof. Jean Gruenberg; Prof. Cem Gabay
Production and functional role of Interleukin-1 receptor antagonist in immune and inflammatory responses in vivoopen archive unige:2554

La famille de l’IL-1 était composée jusqu’à peu de quatre membres, trois d’entre eux possédant des propriétés pro-inflammatoires, l’IL-1α (IL-1F1), l’IL-1β (IL-1F2) et l’IL-18 (IL-1F4), le quatrième étant l’antagoniste du récepteur de l’IL-1, l’IL-1Ra (IL-1F3). Récemment, sept nouveaux membres de la famille de l’IL-1 ont été identifiés de part leur homologie en terme de séquences, de structure tridimensionnelle (3D), de récepteurs et de voies de signalisation intracellulaires : les IL-1F5 à IL-1F10 et l’ IL-33 (IL-1F11) (8-15).

Marie-Hélène Blanchet (Sc. 3951 - 2008) Prof. Daniel Constam (EPFL) ; Prof. Jean Gruenberg
New roles for cripto in the assembly and localisation of nodal signalling platformsopen archive unige:2159

The TGFβ family member Nodal is essential during development to allocate pluripotent cells to distinct germ layers and to establish the basic body plan. To establish a signaling gradient of the transcription factors Smad2 and Smad3, Nodal forms a complex with Activin receptors that is activated with the help of the glycosylphosphosphatidyl-inositol-anchored proteoglycans Cripto or Cryptic. To elucidate the underlying mechanism, we investigated whether Cripto regulates the proteolytic maturation and/or trafficking of Nodal precursor protein. We show that Cripto captures Nodal already during secretion, partly via the propeptide, and assembles a processing complex with the proprotein convertases Furin at the cell surface. Subsequently, Cripto mediates uptake of mature Nodal via a conclathrin, noncaveolar pathway to signaling endosomes. Our results suggest that Cripto is a receptor for proprotein convertases and couples Nodal processing and signaling in target cells

Guillaume Alain Castillon (Sc. 4031 - October 21, 2008) Prof. Howard Riezman
Endoplasmic reticulum exit of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in the yeast 'Saccharomyces Cerevisiae'open archive unige:689

Lors de ce travail de thèse, nous avons étudié la sortie du Réticulum Endoplasmique (RE) des protéines à ancrage Glycosyl Phosphatidyl Inositol (GPI), et plus particulièrement le phénomène de triage des protéines dans la levure. Après l'établissement d'un nouveau protocole de visualisation des protéines à leur sortie du RE par microscopie, nous avons constaté que contrairement à la plupart des molécules cargos, la concentration des protéines à ancrage GPI dans les sites de sortie du RE (ERES) est indépendante du complexe protéique COPII. En revanche le remodelage des chaînes lipidiques de l'ancre GPI est un pré-requis à l'incorporation des protéines à ancrage GPI aux ERES. Ces résultats suggèrent que l'incorporation des protéines à ancrage GPI dans des domaines spécifiques riches en céramides de la membrane du RE est nécessaire à la sortie du RE et au triage des protéines à ancrage GPI.

Maud Déruaz (Sc. 4048 - December 17, 2008) Prof. Jean Gruenberg, Dr Amanda Proudfoot
Novel chemokine binding proteins in tick salivaopen archive unige:2287

Les parasites, tels que les tiques, ont élaboré un large panel de protéines immunomodulatrices qu'ils sécrètent, ce qui leur permet de se nourrir pendant de longues périodes sans être détectés par le système immunitaire de leur hôte. Une stratégie qui permet de produire des protéines qui lient et neutralisent les chimiokines, ayant pour rôle de recruter les cellules immunitaires afin de protéger l'hôte des parasites. Ce manuscrit décrit l'identification et la caractérisation "in vitro" d'Evasin-3 et -4, une étude de structure-fonction d'Evasin-1 et -3 et la caractérisation préliminaire de souris transgéniques exprimant Evasin-3. Evasin-1 et -3 sont très sélectives: Evasin-1 se lie à CCL3, CCL4 et CCL18 et Evasin-3 lie les ELR+ CXC-chimiokines. Evasin-4 a un spectre plus large de liaison avec 13 CC-chimiokines différentes. Les séquences primaires d'Evasin-1 et Evasin-4 s'alignent avec la conservation de la position des résidus cystéines, suggérant une structure tertiaire conservée, alors qu'Evasin-3 est totalement différente.

Anna Kostandinova Kicheva (Sc. 4012 - September 12, 2008) Prof. Marcos González Gaitán
Kinetics and interpretation of the Dpp morphogen gradient in drosophila wing developmentopen archive unige:1477

La croissance et la régionalisation le long de l'axe antéropostérieur du disque d'aile de "Drosophila melanogaster" est dirigé par le gradient du morphogène "Decapentaplegic" (Dpp), un homologue de "BMP". La première partie de cette thèse se concentre sur l'analyse quantitative de la formation du gradient du morphogène Dpp en utilisant un test de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) pour mesurer la cinétique du déplacement de Dpp dans le tissu. La seconde partie s'intéresse à la précision de l'information positionnelle fournie par le gradient de Dpp pour la détermination des frontières des domaines des gènes cibles. La troisième parite de la dissertation explore la façon dont le gradient de Dpp est interprété par les cellules pour générer une réponse en prolifération et diriger la croissance du tissu.

Pierre-Philippe Luyet (Sc. 3942 - January 29, 2008) Prof. Jean Gruenberg ; Prof. Didier Picard
Dynamic properties of endosomal membranes: implications for endocytic sorting and viral infectionopen archive unige:101907

Like other enveloped viruses, vesicular stomatitis virus infects cells through endosomes. There, the viral envelope undergoes fusion with endosomal membranes, thereby releasing the nucleocapsid into the cytoplasm and allowing infection to proceed. Here, we report that the viral envelope fuses preferentially with the membrane of vesicles present within multivesicular endosomes. Then, these intra-endosomal vesicles (containing nucleocapsids) are transported to late endosomes, where back-fusion with the endosome limiting membrane delivers the nucleocapsid into the cytoplasm. Presumably, export of cargo proteins from within endosomes also occurs "via" back-fusion with the limiting membrane, so that they become available for subsequent transport to their final destination. We further find out that this back-fusion process is altered by cholesterol accumulation and is regulated by the ESCRT component Tsg101, the endosomal lipid lysobisphosphatidic acid under the control of Ali/Vps31p and by phosphatidylinositol-3-phosphate "via" SNX16.

Fabiana Tirone (Sc. 4008 - August 21, 2008) Prof. Jean Gruenberg; Dr Jos Adrian Cox
NOX5, a calcium-regulated NADPH oxydase : biochemical and biophysical characterizationopen archive unige:687

Les formes réactives de l’oxygène (FRO) sont des médiateurs importants impliqués dans un grand nombre de processus physiologiques et pathologiques. Les NADPH oxydases (NOX) sont des enzymes spécialisées dans la production des FRO. La première NOX mise en évidence et la mieux étudiée est la NADPH oxydase de phagocytes (NOX2), composée d’un complexe catalytique transmembranaire, gp91phox et p22phox et de quatre sous unités cytosoliques régulatrices, p47phox, p67phox, p40phox et Rac2. La NOX2 est impliquée dans l’immunité innée. Récemment, six homologues de la NOX2 ont été identifiés dans diffèrents tissus et organes: NOX1, NOX3, NOX4, NOX5, DUOX1 et DUOX2. Toutes ces enzymes ont en commun un long domaine C-terminal qui contient les sites d’interaction pour le NADPH et le FAD et six hélices transmembranaires qui contiennent les sites d’ancrage pour deux hèmes. NOX5 contient en plus un long domaine N-terminal régulateur composé de trois sites de type "EF-hand " liant le Ca2+. DUOX1 et DUOX2 contiennent dans leur domaine N-terminal deux motifs EF-hand, une hélice transmembranaire supplémentaire et un domaine peroxydase extracellulaire. Cette étude porte sur la NADPH oxydase 5 (NOX5).

Cleiton Martins de Souza (Sc. 3889 - September 12, 2007) Prof. Howard Riezman
Multiple functions of sterols in yeast 'S. cerevisiae'

Les stérols sont les composants lipidiques majoritaires chez les eucaryotes, et comprendre leurs fonctions au niveau de la membrane plasmique est très important. Néanmoins, la différenciation du rôle des stérols formateurs de microdomaines de celui lié à leur structure spécifique n'est pas encore évidente. Afin de mieux répondre à cette question, nous avons créé un portofolio des souches stables, chacune produisant une espèce de stérol différente (le cholestérol, le campestérol, le 7-dehydrocholestérol et le desmostérol), ainsi qu'un portofolio de mutants de la voie de synthèse de l'ergostérol. Ces souches nous ont révélé que le cholestérol peut promouvoir la formation de microdomaines membranaires chez la levure et que la protéine Pdr12p exige, pour son fonctionnement, des structures spécifiques de l'ergostérol. De plus, nous avons montré que la composition cellulaire des stérols influence celle des phospholipides et des sphingolipides et que stérols et sphingolipides ont des interactions fonctionnelles.

Debdyuti Mukhopadhyay (Sc. 3902 - October 12, 2007) Prof. Howard Riezman
Function and regulation of long chain bases in 'Saccharomyces cerevisiae'open archive unige:3772

Les bases à longues chaines sont des intermédiaires métaboliques de la voie de synthèse des sphingolipides. Elles sont impliquées dans diverses fonctions cellulaires et la perturbation de leur niveau peut être la source de diverses pathologies ; ce qui suppose une régulation fine de ces niveaux dans la cellule. Chez les mammifères, la sphingosine-1-phosphate lyase est l'enzyme-clé pour contrôler le niveau des bases à longues chaînes. Hautement conservée à travers l'évolution, son homologue chez la levure, Dpl1p, est l'enzyme modèle pour découvrir les caractéristiques structurales essentielles à sa fonction. Notre étude a permis d'identifier les résidus-clé du site actif de Dpl1p, et de découvrir que la fonction de Dpl1p dépend de sa capacité à s'homo-oligomériser via son domaine transmembranaire. De plus, Dpl1p est régulée post-traductionnellement par la kinase Pkh2p. Notre travail a ainsi contribué à une meilleure connaissance de la régulation par Dpl1p des bases à longues chaînes.

Michela Felberbaum Corti (Sc. 3809 - 2006) Prof. Jean Gruenberg
Regulation of GDI activity in the cycles of Rab5 and Rab7

Membrane traffic in the endocytic pathway is regulated by members of the Rab family of small GTPases, which control sorting and trafficking at specific transport steps. Rabs are themselves controlled by GTP-GDP exchange and GTP hydrolysis as well as by membrane-cytosol cycles. This latter cycle depends on GDI, a protein that extracts Rab proteins from donor membranes, escorts them in the cytosol and loads them back into the appropriate target membrane. We characterized two separate, but presumably complementary, pathways that control the membrane-cytosol cycle of endosomal RabGTPases, depending on the membrane cholesterol content and the redox state, respectively. Further, regulation of Rab cycling determines Rab functions. Thus, our results indicate that membrane traffic can be controlled by signaling pathways.

Laure Gurcel (Sc. 3801 - 2006) Prof. Françoise Gisou Van der Goot; Prof. Jean Gruenberg
Characterization of a new response to bacterial pore-forming toxin that promotes cell survival in a caspase-1 dependent activation of SREBPsopen archive unige:435

Many pathogenic organisms produce poreforming toxins as virulence factors. Target cells however mount a response to such membrane damage. Here we show that toxin-induced membrane permeabilization leads to a decrease in cytoplasmic potassium, which promotes the formation of a multiprotein oligomeric innate immune complex, called the inflammasome, and the activation of caspase-1. Further, we find that when rendered proteolytic in this context caspase-1 induces the activation of the central regulators of membrane biogenesis, the Sterol Regulatory Element Binding Proteins (SREBPs), which in turn promote cell survival upon toxin challenge possibly by facilitating membrane repair. This study highlights that, in addition to its well-established role in triggering inflammation via the processing of the precursor forms of interleukins, caspase-1 has a broader role, in particular linking the intracellular ion composition to lipid metabolic pathways, membrane biogenesis, and survival.

Karim Khatib (Sc. 3768 - 2006) Prof. Dominique Belin; Prof. Sutart Edelstein
Signal sequence recognition by the "Escherichia coli" protein translocation machinery

Ce travail est une étude génétique de la sécrétion des protéines dans "E. coli". La toxicité d'une séquence signal eukaryote a permis d'isoler un grand nombre de suppresseurs. Nous avons étudié les suppresseurs localisés dans le gène "secA". La première partie du travail a permis de définir que ces mutations affectent essentiellement l'interaction entre séquence signal et transclocase. Dans une deuxième partie, afin de mieux caractériser le "phénotype azide", ces allèles de "secA" ont été combinés avec des allèles de "secY" et "secG". Le résultat majeur de cette étude est que la translocase fonctinne "in vivo" dans un état multimérique. La dernière partie est consacrée à un type nouveau d'interactions génétiques entre les composants de la translocase. L'ensemble des résultats suggère que la reconnaissance de la séquence signal se fait en plusieurs étapes et nécessite un état multimérique de SecYEG, en accord avec l'interprétation proposée ci-dessus.

Roxanne Node-Langlois (Sc. 3771 - 2006) Prof. Dominique Muller; Prof. Marc Ballivet
ARHGEF6 and PAK3 : two X-linked mental retardation genes involved in the regulation of spine morphogenesis in hippocampal neurons

In this thesis project, we studied the roles of the X-mental retardation proteins PAK3 and ARHGEF6 in the post-synaptic regions of rat hippocampal CA1 and CA3 neurons. We demonstrate that knock-down of PAK3 and over-expression of dominant negative PAK3 results in a spine phenotype consisting of abnormally elongated spines and filopodia-like protrusions accompanied by a decrease in mature spines. We further demonstrate that the knock-down of ARHGEF6, known to act upstream of PAK3, results in a similar spine phenotype. This abnormal ARHGEF6 knock-down spine phenotype could be rescued by simultaneous over-expression of constitutively active, but not a wild type, PAK3. Together these results indicate that both ARHGEF6 and PAK3 are implicated in the regulation of dentritic spine morphogenesis and that ARHGEF6 and PAK3 are implicated in the regulation of dentritic spine morphogenesis and that ARHGEF6 influences spine morphology by acting upstream of PAK3.

François Pellissier (Sc. 3792 - 2006) Prof. Marc Ballivet; Dr Vincent Ossipow
Protéines d'adhésions synaptiques : la famille des Necls

L'objectif premier de cette thèse était d'identifier des protéines impliquées dans la plasticité neuronale et de comprendre, au niveau moléculaire, par quels mécanismes l'activité neuronale pourrait influencer la plasticité neuronale. Pour aborder cette étude de manière non biaisée et exhaustive, nous avons opté pour la technique ADDER (amplification of double stranded cDNA end restriction fragments), une variante récente du classique differential mRNA display. Le consensus actuel veut que le programme génétique et l'activité neuronale contribuent de façon majeure à l'organisation des circuits neuronaux. Parmi les molécules qui assurent la jonction entre ces deux types d'influences, on compte un grand nombre de protéines transmembranaires capables d'interaction homo- et hétérophiliques, les CAM ou molécules d'adhésion cellulaire. Nous avons choisi de travailler sur deux membres caractérisés de la famille des CAM, Necl-3 et Necl-4.

Cédric Asensio (Sc. 3604 - 2005) Dr Françoise Rohner-Jeanrenaud; Prof. Jean Gruenberg
Interplay between the [beta]-adrenergic system, adipose secreted factors and energy homeostasis

Nous avons étudié un modèle de souris invalidée pour les 3 récepteurs β-adrénergiques. Ces souris présentent une augmentation de leur masse grasse, un défaut de sécrétion d'insuline, un taux élevé de glucocorticoïdes, une hausse d'expression hépatique de la PEPCK et, étonnamment, une sensibilité à l'insuline accrue. Leur consommation d'oxygène est inchangée après l'administration de leptine. Dans la deuxième partie du travail, nous avons montré une corrélation entre la glycémie et l'expression d'un facteur adipocytaire appelé résistine dans deux modèles d'obésité chez le rongeur, ainsi qu'une diminution de l'expression de la résistine par la leptine médiée par le système nerveux central et dépendant de la forme longue du récepteur à la leptine. Finalement, nous avons identifié un nouveau gène qui code pour une protéine sécrétée encore inconnue qui est exprimée préférentiellement dans le tissu adipeux blanc, dont l'expression est régulée par le système β-adrenergique et qui pourrait contrôler la sécrétion d'insuline.

Julien Chevallier (Sc. 3646 - 2005) Prof. Jean Gruenberg
Synthesis, characterization and function of lysobisphophatidic acid

Nous nous sommes intéressés aux étapes tardives de l'endocytose. Cette voie régule l'internalisation des molécules depuis la membrane plasmique jusqu'à leur destination finale à l'intérieur de la cellule. Le trafic des membranes au niveau de l'endosome tardif est très complexe et peu compris. Au début de ma thèse, un lipide atypique, l'acide lysobisphosphatidique (LBPA) a été découvert enrichi dans ce compartiment. Nous avons dû synthétiser le LBPA par voie organique, le lipide étant instable. A l'aide de cet analogue, nous avons étudié sa fonction. Le BLPA forme des domaines spécifiques dans les membranes internes de l'endosome tardif qui sont importants pour le trafic des molécules dans cette organelle. Ces études ont permis de montrer que sa structure est importante, de légères modifications altérant sa fonction. Nous avons trouvé des protéines interagissant avec ce lipide de manière spécifique et que l'intégrité des domaines LBPA était importante pour le transport du cholestérol.

Hans Gabriel Cruz (Sc. 3695 - 2005) Prof. Christian Lüscher; Prof. Marc Ballivet
Subunit composition and function of Kir3/GIRK channels activated by drugs of abuse

Nous démontrons le rôle des canaux potassiques rectifiant entrants couplés aux protéines G (Kir3/GIRK) à plusieurs niveaux de l'addiction aux drogues. Notre première étude examine le rôle des GIRKs contrôlant l'excitabilité du système dopaminergique mésolimbique, impliquant ainsi les GIRKs dans le système de récompense et dans le désir compulsif associé aux drogues d'abus. Cette étude révèle que l'efficacité de couplage entre le récepteur GABA[B souscrit] (GABA[B souscrit]R) et les GIRKs est plus faible dans les neurones dopaminergiques que dans les interneurones GABAergiques de l'aire tegmentale ventrale (ATV), en raison de l'expression différentielle des sous-unités GIRKs. Cette différence permettrait d'expliquer les effets bidirectionnels des agonistes du GABA[B souscrit]R selon leurs concentrations et leurs affinités. Dans notre seconde étude, nous examinons le rôle des effecteurs du récepteur aux opiacés [mu] dans la dépendance et l'analgésie à la morphine. Nous proposons que les GIRKs jouent un rôle dans l'induction de la dépendance, mais pas dans l'analgésie.

Laetitia Fioraso-Cartier (Sc. 3607 - 2005) Prof. Karl-Heinz Krause; Prof. Stuart Edelstein
Death and birth of neurons : CCR5 and Pax6

La première partie de ma thèse a consisté à déterminer le rôle du corécepteur CCR5 dans la dégénérescence neuronale. Cette étude nous a permis de suggérer que le récepteur CCR5 a une activité double dans la dégénérescence neuronale de type inflammatoire : d'une part, la surexpression du récepteur CCR5 dans les cellules microgliales activées induit la sécrétion de Beta-chimiokines et d'autre part l'activation par ces mêmes chimiokines, du récepteur CCR5 exprimé dans les neurones entraîne la mort neuronale. La deuxième partie de ma thèse a consisté à déterminer le rôle du facteur de transcription Pax6 pendant la neurogénèse. Cette étude nous a permis d'identifier trois éléments dans le mode d'action du facteur de transcription Pax6 : l'établissement d'un phénotype neuronal via l'expression de gènes neuronaux tels la tubuline alpha3, l'établissement d'un phénotype post-mitotique probablement via l'expression de p21 et de p53 et son implication dans la morphologie et la migration cellulaire.

Eva Hammar Bouveret (Sc. 3709 - 2005) Prof. Marc Ballivet; Prof. Philippe Halban
Extracellular matrix-induced signaling pathways and pancreatic beta cell survivalopen archive unige:373

Le but majeur de ce travail de thèse a été de mieux comprendre l'impact de la matrice extracellulaire sur la signalisation intracellulaire des cellules bêta, menant à une meilleure survies. D'autre part, nous avons montré que la matrice extracellulaire favorise la survie de la cellule bêta et que son impact sur l'activité de Akt/PKB et de ERK/MAPK est impliqué dans son effet anti-apoptotique. D'autre part, nous avons montré que cette matrice extracellulaire active le facteur de transcription NF-kB. NF-kB n'est pas impliqué dans l'effet anti-apoptotique de la matrice extracellulaire, mais est impliqué dans l'étalement des cellules et la réorganisation du cytosquelette d'actine induites par la matrice extracellulaire, ainsi que dans la sécrétion de l'insuline. Dans l'ensemble, ce travail de thèse a permis la caractérisaiton des voies de signalisation activées par la matrice extracellulaire et responsables d'une meilleures régulation de la sécrétion et survie des cellules bêta.

Nicolas Molnarfi (Sc. 3677 - 2005) Prof. Jean-Michel Dayer; Prof. Jean Gruenberg
Production of pro- and anti-inflammatory cytokines in human monocytes : regulation and signalingopen archive unige:366

Les tissus vivants répondent aux agressions par l'inflammation qui élimine les agents préjudiciables et initie la guérison des tissus lésés. Les dérèglements de l'inflammation entraînent des pathologies (polyarthrite rhumatoïde (PR), sclérose en plaques (SEP)). Les cytokines pro- (TNF, IL-1β) et anti-inflammatoires (sIL-1Ra), peuvent jouer des rôles salutaires ou délétères dans l'inflammation aiguë/physiologique ou chronique/pathologique. Dans l'inflammation chronique (PR, SEP) les cytokines sont induites par le contact cellulaire direct des monocytes/macrophages avec les lymphocytes T stimulés. Ce travail de thèse a démontré: 1) que l'interaction CD40L-CD40 n'était pas impliquée dans ce mécanisme; 2) que l'IFNβ (traitement de la SEP et la PR) orientait les monocytes vers une fonction anti-inflammatoire dans des conditions d'inflammation chronique, mais pas aiguë ; 3) que l'activation des P13Ks contrôlaient la transcription de sIL-1Ra par les monocytes quel que soit l'activateur ; et 4) que les P13Ks réprimaient la sécrétion d'IL-1β dans l'inflammation stérile ou infectieuse.

Andreas Mühlemann (Sc. 3664 - 2005) Prof. Jean Gruenberg; Dr Patrick Nef
Functional study of neuronal calcium sensor-1 (NCS-1) in yeast and mice : a role for NCS-1 in learning and memoryopen archive unige:358

Ce travail porte sur l'étude du "neuronal calcium sensor-1" (NCS-1). Chez la levure, nous avons montré que la délétion de yeNCS-1 est létale et que NCS-1 d'origine humaine peut se substituer à cette fonction essentielle qui ne semble pas dépendre de l signalisation calcique par yeNCS-1. En plus de générer un mutant de délétion NCS-1δ chez la souris, nous avons produit deux lignées transgéniques de souris (Tg26 et Tg200) qui surexpriment NCS-1 dans des régions restreintes ou étendues du système nerveux. Cette surexpression induit une fatigue synaptique augmentée des motoneurones suggérant un accroissement du relâchement de neurotransmetteurs. Tg26 et Tg200 ont une LTP et une facilitation "paired-pulse" améliorée qui corrèlent avec les quantités de protéine NCS-1 dans l'hippocampe. Comme le révèlent deux modèles cognitifs, les souris Tg26 ont des performances mnésiques supérieures. Ces résultats indiquent que la signalisation via Ca2+/NCS-1 régule la plasticité synaptique et la mémoire par un mécanisme présynaptique.

Komla Sobo (Sc. 3625 - 2005) Prof. Gisou Van der Goot Grünberg; Prof. Howard Riezman
Role and characterization of raft-like domains in late endocytic compartments

Les endosomes tardifs, organites de la voie endocytaire, jouent un rôle dans la dégradation et le trafic moléculaire. Des maladies dites "lysosomal storage diseases" provoquent une déficience fonctionnelle et une accumulation de lipides dans ces compartiments. C'est le cas du Niemann-Pick C type 1 (NPC1), caractérisé par une accumulation excessive de cholestérol dans l'endosome. Les radeaux lipidiques, biochimiquement définis comme des membranes résistant à la solubilisation par détergeants non-ioniques à froid (DRMs) sont riches en cholestérol et sphingolipides. Nous avons caractérisé biochimiquement ces DRMs au niveau des endosomes tardifs soit dans des cellules contrôles ou dans des conditions mimant les cellules NPC1. Dans ces conditions pathologiques, les DRMs n'étaient pas quantitativement affectés mais altérés dans leur dynamique, ce qui pourrait être à l'origine du disfonctionnement des endosomes tardifs.

David-Nicolas Chaperon (Sc. 3498 - 2004) Prof. Costa Georgopoulos
Complementation of the "Escherichia coli" genes thymidine kinase "tdk" and thymidylate kinase "tmk" by viral, fungal and mammalian homologues : a recombinant bacterial screening system for nucleoside analogues with potential activity against cancer and in

Cette thèse rapporte la construction d'une souche "E. coli" mutante de la thymidylate kinase "tmk". Ceci permet de tester "in vivo" ou "in vitro" la phosphorylisation d'analogues nucléosiques par différentes thymidylates kinases ou de cribler des inhibiteurs de kinases médicalement importantes. La souche mutante "tmk" a été complémentée par les thymidylates kinases du bactériophage "T4", de "S. cerevisiae", d'"E. coli" et aussi par l'homologue humain dTYMK surproduit à partir d'un plasmid. En cas d'exposition à l'analogue nucléosique AZT, 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine,Zidovudine, les bactéries transgéniques présentent une réduction de croissance dépendante de la thymidylate kinase utilisée (96).

Patrick Alexandre Keller (Sc. 3491 - 2004) Prof. Jean-Paul Giacobino; Prof. Jean Gruenberg
Stratégies de clonage du récepteur CART (Cocaine-and amphetamine-regulated transcript)

CART (cocaine and amphetamine regulated transcript) a été identifié par PCR différentielle chez le rat comme étant surexprimé en réponse aux psychostimulants. Ceci suggère que ce peptide joue un rôle important dans le mécanisme d'action de certaines drogues. Kirstensen et al. ont démontré que CART est un puissant peptide anorexigène. On a aussi démontré que CART pourrait jouer un rôle dans le contrôle de la douleur. Ce travail de thèse montre un certain nombre de stratégies que nous avons employées afin de cloner le récepteur CART. Il décrit la mise au point de ligands, qui pour la première fois, ont montré une liaison spécifique aux sites de liaison du récepteur CART. De plus, ce travail de thèse décrit le clonage et la caractérisation d'une protéine découplante homéotherme chez "Xenopus laevis".

Jian Li (Sc. 3529 - 2004) Prof. Karl-Heinz Krause; Dr Marisa Jaconi
Molecular mechanisms of cardiomyocyte differentiation from mouse embryonic stem cells : role of Ca2+ and reactive oxygen species

Ce travail de thèse a élucidé deux mécanismes moléculaires régulant la différenciation des cellules souches embryonnaires (CSE) murines en cardiomyocytes : le rôle du calcium intracellulaire libre et l'action des radicaux libres de l'oxygène (ROS). Les CSE déficientes en calréticuline ont une différenciation cardiaque défectueuse en l'absence d'un signal calcique, permettant la translocation nucléaire de facteurs de transcription tels que MEF2C. Cette étape est nécessaire à l'expression de la chaîne légère de myosine (MLC2v) et à la sarcomérogenèse. Il en est de même en l'absence de NOX4. Deux voies de signalisation intracellulaire peuvent donc réguler la différenciation cardiaque: la première dépendante du Ca2+ et de kinases Ca2+/Calmoduline dépendantes et la deuxième régulée par les ROS produits par NOX4 qui activent la p38 MAPK. Ces deux voies de signalisation convergent au niveau de MEF2C en induisant sa translocation nucléaire, à la base de l'expression de protéines sarcomériques cruciales pour la sarcomérogenèse.

Carine Poussin (Sc. 3507 - 2004) Prof. Jean-Claude Chevrolet; Dr Jérôme Pugin
Innate cell recognition of Lipopolysaccharide and other bacterial moleculesopen archive unige:257

Une étape critique de la pathogenèse du sepsis est la reconnaissance des molécules bactériennes telles que les lipopolysaccharides (LPS) par les cellules de l'immunité innée. L'interaction du LPS, complexé à la "lipopolysaccharide binding protein" (LBP), avec les récepteurs CD14 et TLR4/MD-2 présents à la surface des cellules myéloïdes induit l'activation cellulaire. Parallèlement, afin d'être détoxifié, le LPS est internalisé de façon dépendante du CD14 par une voie de macropinocytose dans les macrophages. Le complexe récepteur TLR4/MD-2 est nécessaire pour transmettre le signal induit par le LPS au niveau intracytoplasmique. Durant la différenciation des cellules myéloïdes en macrophages ou en cellules dendritiques immatures et matures, l'expression de TLR4, MD-2, et CD14 est modulée et ceci semble conditionner la réponse des cellules au LPS. Par conséquent, la famille des TLRs et le MD-2 constituent de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de traitements spécifiques pour la maladie du sepsis.

Dorota Skowronska-Krawczyk (Sc. 3511 - 2004) Prof. Marc Ballivet; Dr Jean-Marc Matter
Regulation of neuronal promoters during retina ontogenesis : the role of basic helix-loop-helix transcription factor

Ce travail a consisté à élucider quelques mécanismes moléculaires responsables de la régulation de gènes spécifiquement exprimés dans des neurones centraux au cours du développement du système nerveux. Les nouvelles approches expérimentales que nous avons pu mettre en oeuvre pour étudier la fonction de divers facteurs de transcription, nous ont permis de révéler des propriétés nouvelles. Parmi celles-ci, nous avons montré que les interactions très dynamiques entre les facteurs de transcription et leurs promoteurs cibles traduisent leurs fonctions transitoires au cours de la spécification et la différentiation des cellules ganglionnaires de la rétine. De plus, il existe une très bonne corrélation entre les modifications de la chromatine que nous avons détectées et l'expression génique liée à cette différentiation. Finalement, nous avons montré que les interactions entre les protéines activatrices et répressives sont cruciales pour l'établissement d'un modèle d'expression génique.

Odile Ducrey (Sc. 3434 - 2003) Prof. Didier Trono; Prof. Jean Gruenberg
Inducers of HIV permissiveness in resting T lymphocytes

L'état d'activation ainsi que le cycle cellulaire des lymphocytes T primaires conditionnent leur susceptibilité à une infection par le VIH (virus de l'immunodéficience humaine). Alors que les lymphocytes T au repos ne répliquent pas le virus, différents stimuli peuvent les induire vers un état de susceptibilité. Analysant les modalités par lesquelles l'interleukine-7 exerce cet effet, j'ai démontré que l'acquisition de la susceptibilité de ces cellules traitées à l'IL-7 corrèle parfaitement avec la phase G1b du cycle cellulaire. De plus, l'activation du facteur de transcription NFATc n'est pas induit par l'IL-7 - et donc la cyclosporin A n'inhibe pas leur susceptibilité - suggérant une voie de signalisation distincte de celle utilisée durant l'activation par le récepteur des cellules T (TCR). De plus, la wortmannin, inhibiteur de la P13K, bloque la survie des cellules sans inhiber leur susceptibilité, prouvant que la permissivité ne passe pas par la P13K et donc très vraisemblablement via Jak-STAT.

Julio Hernandez (Sc. 3437 - 2003) Prof. Marc Ballivet; Dr Jean-Marc Matter
Regulation of the ATH5 promotor during early retina development

Le gène ATH5 code pour un facteur de transcription du type basic Helix-Loop-Helix (bHLH). Chez plusieurs espèces de vertébrés, ATH5 est principalement exprimé dans la rétine et très localement dans d'autres populations neuronales. Dans la rétine, plusieurs études ont montré que le gène ATH5 est essentiel à la formation des cellules ganglionnaires. Dans notre laboratoire, nous avons isolé l'homologue du poulet et étudié différents aspects de son expression et de sa régulation. ATH5 est exprimé très tôt dans le développement dans des cellules qui prolifèrent et qui sont les précurseurs des cellules ganglionnaires, puis transitoirement dans les cellules ganglionnaires qui achèvent leur diférenciation. ATH5 active plusieurs gènes cibles dont le gène β3 en se liant à une boîte E située dans le promoteur. Nous avons isolé le promoteur du gène ATH5 puis cloné celui-ci en amont d'un gène reporter et analysé son activité par transfection dans des cellules de la rétine, isolées à plusieurs states de développement. Nous avons identifié plusieurs éléments impliqués dans la régulation du gène ATH5, dont plusieurs boîtes E, lesquelles contribuent de manière différente à l'activité du promoteur. Nos travaux indiquent qu'au cours du développement ATH5 est régulé par plusieurs facteurs de transcription bHLH présent dans la rétine en utilisant différentes combinaisons de boîtes E.

Stephan Ryser (Sc. 3422 - 2003) Prof. Werner Schlegel; Dr Martine Collart Burkhard
Etude du gène de réponse précoce MKP-1 (MAP kinase phosphatase-1) comme modèle de régulation de l'élongation de la transcription

Le contrôle des voies de signalisation des MAP kinases, par l'expression de MAP kinase phosphatases, est fondamental dans la spécificité de réponses cellulaires. Le gène codant pour la MAP kinase phosphatase-1 (MPK-1) est activé de manière rapide et transitoire par plusieurs voies de signalisation dont le calcium et les MAP kinases. Dans les cellules neuroendocrines, l'activation de la transcription de ce gène passe par un contrôle strict au niveau de l'élongation de la transcription. En conditions non-stimulées, l'initiation du gène MPK-1 est importante et associée à plusieurs éléments du promoteur. Le contrôle s'effectue par la présence d'un bloc à l'élongation dans le premier exon. Suite à une stimulation par les hormones TRH et EGF, le bloc est levé et permet la synthèse du messager. Ce bloc, à l'élongation sensible aux voies de signalisation par le calcium, est un élément décisif dans le contrôle de la transcription de MKP-1.

Fabrizio Thorel (Sc. 3425 - 2003) Prof. Marc Ballivet; Prof. Stuart G. Clarkson
Etude fonctionnelle de protéines XPG mutées chez les patients XP-G et XP-G/CS

Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) permet d'éliminer une variété de lésions sur l'ADN dont les dommages induits par les rayons ultraviolets. Les mutations affectant le gène XPG codant pour l'endonucléase responsable des incisions 3' lors de la NER, sont associées chez l'Homme aux maladies génétiques du xéroderma pigmentosum (XP) et du syndrome de Cockayne (CS). Les individus XP-G atteints par le XP possèdent un défaut NER alors que les patients CS sont déficients pour le mécanisme de réparation couplée à la transcription (TCR). La caractérisation des mutations naturelles au niveau du gène XPG a permis de mieux comprendre la corrélation entre le génotype et le phénotype chez les patients XP-G et XP-G/CS. Par ailleurs, l'analyse fonctionnelle de protéines XPG mutée a révélé que la fonction NER de XPG est dépendante de sa capacité à interagir correctement avec son partenaire TFIIH au sein du complexe NER.

Andrès José Casal (Sc. 3385 - 2002) Prof. Alessandro M. Capponi; Prof. Stuart J. Edelstein
Expression and modulation of the mRNA for the steroidogenic acute regulatory (StAR) protein and the scavenger receptor B1 in rat cardiomyocytes and after myocardial infarction

L'aldostérone est synthétisée dans une zone glomérulée du cortex surrénalien. La première étape de la stéroïdogenèse consiste en la prise sélective du cholestérol par le récepteur éboueur SR-B1. Le cholestérol est ensuite transféré à l'intérieur de la mitochondrie afin d'être métabolisé en aldostérone. Cette étape est facilitée par la protéine StAR. Des travaux récents ont montré que le coeur est également capable de générer des stéroïdes. Il restait néanmoins à déterminer si les étapes précoces de la stéroïdegenèse, telles que la prise du cholestérol par SR-B1 et de son transfert dans la mitochondrie par la protéine StAR étaient également présentes. Dans ce travail, nous avons démontré que ces deux facteurs cruciaux étaient exprimés et modulés dans les cardiomyocytes de rats nouveau-nés ainsi que suite à un infarctus du myocarde chez le rat adulte. Nos travaux ont ainsi démontré que le coeur possède toute la machinerie nécessaire à la biosynthèse d'aldostérone.

Fabio D'Atri (Sc. 3391 - 2002) Prof. Stuart Edelstein; Dr Sandra Siti
Structure and function of the tight junction protein cingulin

Le but de cette thèse a été de clarifier la structure et les fonctions de la cinguline, une protéine associée à la partie cytoplasmique des jonctions étanches (Tight Junctions). Après l'identification de la séquence de cADN codant pour la cinguline de "Xenope" et humaine, nous avons pu déterminer sa structure moléculaire, ses interactions avec d'autres protéines des jonctions étanches et commencer à évaluer son rôle fonctionnel.

Grégory Emery (Sc. 3334 - 2002) Prof. Jean Gruenberg
Targeting and possible role of transmembrane proteins of the p24 family

Au cours de cette thèse, le rôle et l'adressage de membres de la famille p24 de protéines transmembranaires ont été étudiés. A l'aide de différentes méthodes de biologie cellulaire, moléculaire et de biochimie, il a été montré que ces protéines sont extrêmement abondantes dans une cisternae de l'appareil de Golgi (cis-Golgi), qu'elles sont interdépendantes pour leur adressage correct, p23 et p24 interagissant initialement pour la formation d'un complexe permettant la sortie du réticulum endoplasmique et p25 servant d'ancrage pour la rétention des complexes formés. L'utilisation de différents mutants a permis la compréhension des différents signaux d'adressage de ces protéines. De plus, lorsque ces protéines sont artificiellement localisées dans d'autres organelles, elles causent soit une réorganisation morphologique de ces compartiments, soit la formation de domaines perturbant la fonction de ces organelles. Ensemble, les résultats obtenus démontrent l'importance de ces protéines dans l'organisation et la morphologie de l'appareil de Golgi.

Marcelino Ferrer Alcón (Sc. 3322 - 2002) Prof. José Guimón; Prof. Stuart Edelstein; Prof. Jésus A. Garcia
Modulation et mécanismes régulateurs du récepteur [mu]-opioïde, des voies de signalisation associées et des neurofilaments dans l'addiction aux opiacésopen archive unige:120

L'exposition répétée aux opiacés produit des changements des fonctions cérébrales qui peuvent durer un certain temps après l'interruption de l'administration chronique de la drogue. Dans le cortex préfrontal des cerveaux des sujets addicts aux opiacés qui se trouvent dans un état de tolérance/dépendance, le récepteur [mu] ainsi que les protéines régulatrices GRK2/6 et ß-arrestine2 sont diminués. La densité de PKA et de CREB n'est pas modifiée dans le même groupe de sujets. Par contre, l'immunoréactivité des ERK1/2 est diminuée chez ces sujets, ainsi que les niveaux du complexe p35/cdk5, dont l'implication est pour la première fois démontrée dans le processus d'addiction aux opiacés. Chez ces mêmes sujets, il existe une diminution des formes non-phosphorylées des neurofilaments accompagnée d'une hyperphosphorylation de ces protéines. Les résultats présentés dans ce travail de thèse indiquent que les opiacés peuvent induire des adaptations et des modifications neuronales importantes dans le cerveau humain.

Paula Galhofas Raposinho (Sc. 3406 - 2002) Prof. Michel Lucien Aubert; Prof. Maria Teresa Carreira
Potential role in the neuroendocrine regulation of growth and reproduction of various peptides that are primarily involved in the hypothalamic control of feeding and energy balance

Le neuropeptide Y (NPY) et l'antagoniste endogène des mélanocortines (MC), "Agouti-Related Peptide" (AGRP), stimulent l'appétit alors que le peptide "Cocaine-Amphetamine Related Transcript" (CART) et les MC - principalement l'α-MSH - stimulent la satiété. Le but de cette étude a été d'analyser lequel des neuropeptides ou leurs récepteurs, impliqués dans le contrôle de l'appétit et du métabolisme, pouvait également moduler, au niveau central, les axes somatotrope et gonadotrope en fonction des conditions métaboliques. Le NPY a inhibé l'axe de la reproduction chez le rat principalement via le récepteur Y5. Les récepteurs Y1 et Y5 semblent être redondants dans le contrôle de l'appétit et de la balance énergétique car le NPY a induit une obésité similaire chez les souris transgéniques Y1-/- et Y5-/-. Les antagonistes du récepteur MC4 ont entraîné une obésité, alors que les agonistes correspondants ont fait régresser l'obésité dans les modèles caractérisés par un relâchement excessif de NPY au niveau central. En conclusion, le système MC interagit avec le NPY dans la régulation de la balance énergétique mais pas dans celle des fonctions neuroendocriniennes, telles que la reproduction et la croissance.

Ernesto Guarin (Sc. 3369 - 2002) Dr Patrick Nef; Prof. Marc Ballivet
Molecular and biochemical characterization of Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase II isoforms in "C. elegans"

La protéine kinase Ca2+/Calmodulin-dependent II (CaMKII) chez le "C. elegans" étant associé à une multitude de phénotypes, nous avons décidé d'étudier ses propriétés moléculaires et biochimiques, afin de mieux comprendre ses divers rôles. Nous avons montré que, dans "C. elegans", un seul gène code pour la CaMKII mais il génère différents isoformes par épissage différentiels. Huit cDNA différents ont été clônés, séquencés et la structure du gène a été déterminée. Les différentes formes recombinantes ont ensuite été exprimées afin de les caractériser biochimiquement (propriétés catalytiques, auto-phosphorylation, accrochage de la calmodulin). Nous avons aussi commencé à déterminer le rôle de CaMKII dans la mémoire associative du "C. elegans". Les résultats de cette étude montrent que, bien que codée par un seul gène, CaMKII est une enzyme très diversifiée et que ses propriétés biochimiques sont restées très conservées au cours de l'évolution, suggérant un rôle fondamental de cette kinase dans des fonctions cellulaires clés.

Marc Fivaz (Sc. 3293 - 2001) Prof. Jean Gruenberg; Dr Françoise Gisou Van der Goot
Identification and endocytic membrane transport of GPI-anchored proteins

Ce travail de thèse a eu pour but l'étude d'une famille de protéines ancrées à la membrane plasmique par un pied glypié (GPI-anchored proteins). A l'aide de l'aérolysine, une toxine bactérienne qui se lie spécifiquement aux protéines GPI, nous avons cartographié et identifié les protéines GPI endogènes aux types cellulaires CHO et BHK. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé l'aérolysine pour explorer la distribution intracellulaire et le trafic membranaire des protéines GPI dans les cellules CHO et BHK. Nos observations ont montré que le trafic des protéines GPI dans la voie de l'endocytose diffère selon le type cellulaire considéré. Dans CHO, les protéines GPI internalisées sont recyclées à la membrane plasmique par l'intermédiaire de l'endosome de recyclage, alors que dans BHK, elles sont directement acheminées vers les endosomes tardifs. Ce tri différentiel semble dépendre d'une incorporation des protéines GPI dans des domaines lipidiques différents.

Marc Princivalle (Sc. 3258 - 2001) Prof. Werner Schlegel; Dr Ariane De Agostini
Study of anticoagulant heparan sulfate proteoglycans in reproduction : expression pattern in rodents and human ovary, and reproductive function in transgenic mice models

Cette thèse étudie le rôle des héparan sufate protéoglycans anticoagulants (aHSPG) dans la physiologie de la reproduction des rongeurs et des humains. L'AT, la PN-1 et PAI-1 sont des serpines dont la principale caractéristique, à part celle d'inhiber les sérines protéases, est d'être coactivée par l'héparine ou par son homologue physiologique, les aHSPG. Ce travail démontre la présence des aHS dans des compartiments extravasculaires et dans tout le tractus génital des rongeurs et ceci en colocalisant avec les serpines. D'autre part, une approche transgénique du gène de la 3-O-sulfotransférase-1 démontre le rôle fondamental de cette enzyme de biosynthèse des aHS dans la reproduction des rongeurs. En effet, les souris knockout pour ce gène développent des phénotypes de reproduction importants comprenant un phénotype du pénis et des yeux. Cette étude démontre pour la première fois, les fonctions des aHS en dehors du contexte vasculaire et en dehors de leur fonction antithrombotique.

Sibyl Baladi (Sc. 3148 - 2000) Prof. Jean Gruenberg; Dr Jos A. Cox
A structure-function study of the N- and C- terminal domains of amphioxus calcium vector protein : mapping the interactive domains for target binding

La protéine CaVP de l'amphioxus a été caractérisée en termes de structure et d'interactions moléculaires avec sa cible CaVPT. Il a été démontré que les protéines CaVP recombinante et de type sauvage ont des propriétés semblables. Le domaine N-terminal ne lie pas le calcium. La région C-terminale lie deux ions calcium avec des affinités similaires à la CaVP, et des changements conformationnels prononcés. Le segment C-terminal présente en absence de calcium des caractéristiques d'un "molten globule" ; il possède en présence de calcium une structure tertiaire similaire à une paire de motifs "EF-hand". La liaison du calcium s'effectue par étape avec un intermédiaire stable, constitué d'un site III structuré. Les segments N- et C-terminaux n'interagissent pas entre eux. Cependant, le domaine C-terminal de la CaVP entière influence la stabilité du domaine N-terminal. La moitié C-terminale de CaVP lie la CaVPT, alors que la moitié N-terminale n'interagit avec aucune protéine de l'amphioxus.

Valeria Cavalli (Sc. 3230 - 2000) Prof. Jean Gruenberg
Regulation of endocytic trafficking via RabGDI and the mitogen-activated protein kinase p38

La petite GTPase Rab5, un régulateur clé du transport dans les étapes précoces de l'endocytose, cycle entre les formes liées au GTP et au GDP, ainsi qu'entre les formes membranaires et cytosoliques. Ce dernier cycle dépend de la protéine GDI (GDP Dissociation Inhibitor) qui possède la propriété d'extraire une Rab (liée au GDP) de la membrane, et ensuite de la recharger, cycle dont la régulation était mal comprise jusqu'à maintenant. Nous avons montré que la formation du complexe GDI :Rab5 est stimulée par un facteur cytosolique que nous avons purifié et identifié comme étant la MAP kinase p38. La protéine p38 régule GDI dans le cycle cytosolique de Rab5 et module l'endocytose in vivo.Ces observations révèlent l'existence d'un réseau de régulation entre la cascade de signalisation p38-dépendante et le transport dans la voie de l'endocytose et révèlent les mécanismes moléculaires indiquant que l'endocytose peut être régulée par le milieu extracellulaire.

Raluca Gagescu (Sc. 3156 - 2000) Prof. Jean Gruenberg
Characterization of recycling endosomes in polarized epithelial cells

Dans la voie de l'endocytose, le recyclage s'effectue depuis l'endosome de tri, en passant par l'endosome de recyclage. La relation entre ces deux populations endosomales n'est pas claire. Pendant ce travail de thèse, l'endosome de recyclage a été purifié par fractionnement subcellulaire, et sa composition moléculaire a été analysée. Ce compartiment est enrichi en récepteur de la transferrine, rab4, rab11, cellubrevine, cavéoline et les lipides cholestérol et sphingomyéline. Il est par contre dépourvu d'annexine II, ATPase vacuolaire et EEA1, et pauvre en rab5. En accord avec l'absence d'ATPase vacuolaire, le pH de cet endosome est moins acide que celui de l'endosome de tri. Ces observations indiquent que l'endosome de recyclage est une organelle distincte de l'endosome de tri, qui pourrait contenir des microdomaines membranaires de type radeau lipidique, impliqués dans le tri moléculaire.

Ming Thong Ong (Sc. 3187 - 2000) Prof. Marc Ballivet; Dr Jean-Marc Matter
Dynamic expression of bHLH transcription factors during development of the chick central nervous system

J'ai entrepris l'étude détaillée et systématique de l'expression d'homologues des gènes "atonal" et "achaete-scute" (qui servent chez la "Drosophile" à la détermination neurale) au cours du développement de la rétine et de la moelle épinière de l'embryon de poulet. L'analyse de mes résultats a révélé plusieurs constantes d'un grand intérêt fonctionnel, en accord avec des observations faites dans le laboratoire par d'autres techniques, en particulier par les cotransfections de divers couples promoteurs/protéines bHLH destinées à élucider les mécanismes moléculaires des cascades de facteurs bHLH. J'ai pu montrer en particulier la complémentarité des territoires exprimant "cASH1" d'une part et le couple "cATH5/cNgn2" d'autre part, dans la rétine et dans la moelle épinière, observations qui prennent tout leur intérêt lorsqu'on sait que nous avons montré par ailleurs que le promoteur du gène "cATH5" est spécifiquement réprimé par "cASH1" et stimulé par "cNgn2" dans les cellules rétiniennes.

Frédéric Preitner (Sc. 3224 - 2000) Prof. Jean-Paul Giacobino
Invalidation du récepteur β₃-adrénergique et métabolisme énergétique chez la souris

Le récepteur β₃-adrénergique est exprimé majoritairement dans les tissus adipeux brun et blanc où il coexiste avec les sous-types β₁/β₂. Afin d'étudier son rôle dans l'homéostasie énergétique relativement aux sous-types β₁/β₂, nous avons invalidé ce récepteur chez la souris par recombinaison homologue. L'absence du récepteur β₃ n'entraîne curieusement pas de défaut d'adaptation au froid mais favorise, en présence d'un régime riche en graisse, une tendance à l'adiposité, une hyperphagie et une modification de la relation entre masse grasse et leptinémie. Les résultats obtenus in vitro indiquent que le récepteur β₃ n'est pas indispensable à une réponse thermogénique normale du tissu adipeux brun mais crucial pour une réponse lipolytique du tissu adipeux blanc aux catécholamines. Le modèle a en outre permis l'analyse d'un nouveau sous-type β-adrénergique pharmacologique, le récepteur β₄, qui serait exprimé dans le coeur, le tissu adipeux brun et le colon.

Alexandra Richardson (Sc. 3150 - 2000) Prof. Costa Georgopoulos
Function/structure studies of the bacteriophage T4-encoded co-chaperonin, Gp31, with emphasis on co-chaperonin mobile loop interactions with GroEL

D'une façon générale, les chaperonines aident un large spectre de protéines à se replier. Dans cette étude, nous utilisons deux modèles pour comprendre comment les chaperonines et leurs co-facteurs choisissent de façon différentielle entre ces divers substrats. Dans la première situation, la protéine majeure de la capside du bactériophage T4, Gp23, a besoin de GroEL et de Gp31 pour empêcher son aggrégation. Gp31 ne peut pas être remplacé par GroES ou par aucun autre homologue de GroES déjà testé. Dans le deuxième cas, alors que la GroEL bactérien peut fonctionner avec différents partenaires, le chaperon humain Hsp60 travaille spécifiquement avec son partenaire Hsp10 et non pas avec d'autres co-chaperonines tels que GroES ou Gp31. En utilisant des analyses génétiques, biochimiques, et biophysiques, ces études ont aidé à définir le rôle joué par les co-chaperonines ; en plus d'être un élément structurel de la machinerie des chaperonines, les co-chaperonines pourraient aussi avoir une fonction de modulateur allostérique.